PSA - 16 a aidé les chercheurs du laboratoire national d'ingénierie conjointe locale des technologies de développement des anticorps de l'Université du Henan à publier un article intitulé "attention of Cardiac Ischemia / reperfusion injury via the decoy receptor dcr2 by Targeting the Plad Domain of the death receptor dr5" dans la revue International Journal of Biological Macromolecules en mars 2025.

Cette étude visait à identifier la cible d'action de dcr2 et à explorer le mécanisme de protection du muscle cardiaque de dcr2 dans les lésions I / R du muscle cardiaque chez la souris. Les résultats montrent que la protéine de fusion hdcr2 - FC a un effet protecteur significatif contre les lésions ischémiques / reperfusionnelles du myocarde. Dcr2 forme un complexe hétérologue avec dr5 par l'intermédiaire de son domaine Plad qui ne possède pas de domaine mort complet et ne peut donc pas transmettre de signaux en aval. De plus, la formation du complexe masque le site d'interaction avec le Ligand Trail, ce qui atténue la mort des cardiomyocytes après une lésion ischémique / reperfusionnelle. Cette étude révèle donc que le domaine Plad de dcr2 joue un rôle clé dans l'inhibition de l'apoptose, fournissant une cible potentielle pour la recherche et le développement de nouveaux médicaments.

Lijie Zhang, Xinyuan Zhang, Ziting Li, Tingting Mo, Wanting Feng, JingLun Zhang, Dan Zhao, Ying Wang, Yinxiang Wei, Yaohui Wang

Laboratoire national conjoint pour l'ingénierie des médicaments anticorps, le premier hôpital affilié, Université de Henan, Kaifeng, Chine

École de médecine, Université de Henan, Kaifeng, Chine

Laboratoire national conjoint pour l'ingénierie des médicaments anticorps, Université de Henan, Kaifeng, Chine

Zhou, D. et al.

La stabilité thermique de la protéine se réfère à la capacité de transformation de la chaîne polypeptidique de la protéine sous l'influence de la température, qui se manifeste principalement par des changements dans les caractéristiques chimiques et la conformation spatiale de la chaîne polypeptidique lorsque la température change, plus le changement est faible, plus la stabilité thermique est élevée. La stabilité thermique des protéines est influencée par différents facteurs externes tels que la température, le pH, la Force ionique, etc. et revêt une grande importance dans des domaines tels que la biotechnologie, la recherche et le développement de médicaments, ainsi que l'industrie alimentaire.

La température de dénaturation des protéines est un concept important pour les biologistes qui étudient la stabilité thermique des protéines, c'est - à - dire le point de température où la structure d'une protéine change lorsqu'elle est soumise à l'action thermodynamique dans des conditions de température spécifiques, et lorsque la température générale est élevée, la protéine passe d'une structure tridimensionnelle stable à une structure désordonnée lâche. La stabilité thermique d'une protéine est généralement exprimée en utilisant la température du point médian de dénaturation thermique (TM), c'est - à - dire la température à laquelle la protéine est repliée à 50%.

01 Préface

Ischémie la mort des cellules du muscle cardiaque causée par l'hypoxie est la principale cause de lésions du muscle cardiaque. Dcr2 est un récepteur trompeur de Trail et le rôle de dcr2 dans les lésions ischémiques / reperfusionnelles (I / R) du myocarde est inconnu. Des études récentes ont montré que dcr2 ne se lie pas seulement à Trail en tant que récepteur, mais bloque également l'apoptose induite par Trail in vitro en tant que Ligand de dr5, mais la préférence de dcr2 pour Trail ou dr5 in vivo est inconnue. Des études antérieures ont montré que la protéine de fusion hdcr2 - FC joue un rôle cardioprotecteur dans des modèles murins de lésions I / R du muscle cardiaque, en réduisant l'apoptose. La détermination de l'affinité a montré que dcr2 avait une affinité plus grande pour dr5 que pour Trail et que dcr2 préférait se lier à dr5. Des études mécanistes ont montré que la délétion de Plad élimine l'effet protecteur de hdcr2 - FC contre les lésions myocardiques induites par I / R. Dcr2 forme un complexe hétérologue avec dr5 par un domaine Plad similaire. Pris ensemble, cette étude a révélé que dcr2 peut former des complexes hétérologues en ciblant dr5 via le domaine Plad, bloquant l'apoptose et améliorant ainsi les lésions I / R du myocarde, offrant de nouvelles stratégies préventives pour le traitement des lésions I / R du myocarde.

02 Résumé

L'infarctus aigu du myocarde (Iam) est une maladie qui menace gravement la vie et la santé humaines, et le taux de mortalité par iam reste élevé dans le monde entier. La mort des cardiomyocytes causée par l'hypoxie ischémique est une blessure irréversible. L'intervention coronarienne percutanée (ICP) est efficace pour réduire la mortalité chez les patients atteints d'infarctus aigu du myocarde, mais il existe deux problèmes majeurs, à savoir la courte durée dorée du traitement et les lésions ischémiques / reperfusionnelles (I / R). En outre, l'incidence de l'insuffisance cardiaque à long terme est également élevée. Pour réduire la portée de l'infarctus du myocarde, prolonger la « fenêtre» de la mort des cellules du myocarde et améliorer le pronostic à long terme des patients, il est nécessaire de développer de nouveaux traitements capables de réduire ou d'inverser les lésions cardiaques.

L'infarctus du myocarde s'accompagne généralement de nombreux changements pathologiques, dont le plus grave est l'apoptose myocardique. Cependant, il n'existe pas de stratégie efficace dans le traitement de l'apoptose myocardique. Par conséquent, la recherche de cibles clés pour prévenir l'apoptose myocardique pourrait offrir de nouvelles stratégies pour la prévention et le traitement de l'infarctus du myocarde. Le facteur de nécrose tumorale (TNF) associé au Ligand induisant l'apoptose (Trail), également appelé Ligand apo2, appartient à la superfamille des Ligands TNF. À ce jour, cinq récepteurs Trail ont été identifiés chez l'homme. Dr4 (Trail - R1) et dr5 (Trail - R2) sont connus sous le nom de récepteurs de mort (Dr) et ont un domaine de mort complet (DD) capable de transmettre des signaux de mort régulés par Trail. Les Dr médient l'activation des voies de signalisation en aval associées, ce qui conduit à l'apoptose, où dr5 est le principal récepteur de la mort.AuteurDes études antérieures ont confirmé que la protéine de fusion sdr5 - FC peut bloquer spécifiquement la voie Trail - dr5, améliorant ainsi la fonction cardiaque après un infarctus du myocarde chez le singe, le porc et le rat.

03 résultats

Pour déterminer si Plad Médie la liaison de dcr2 à dr5,AuteurUne protéine de fusion dcr2Δplad - FC délétée du domaine Plad a été préparée. L'élimination du domaine Plad n'a pas affecté la structure secondaire de dcr2, mais sa température de fusion (TM) a légèrement diminué, ce qui indique une diminution de sa stabilité. L'affinité de dcr2aplad - FC pour Trail a ensuite été déterminée à 4724 × 10 - 7 m, légèrement inférieure à celle du type sauvage. Les résultats des expériences de blocage de l'apoptose ont montré que dcr2 ne pouvait pas bloquer l'apoptose après l'élimination du domaine Plad, ce qui confirme l'importance du domaine Plad.

Les auteurs ont également effectué une analyse de la stabilité thermique de la Niv G - ferritine et du Niv SG selon le principe de la fluorimétrie à balayage différentiel (DSF) à l'aide de l'analyseur de stabilité des protéines PSA - 16 et ont montré que la Niv G - ferritine et le Niv SG présentaient une stabilité thermique similaire avec un TM de ~ 65 °C, ce qui indique que la fusion du Niv G et de la ferritine n'avait pas d'effet significatif sur leur stabilité structurelle.

Comme la Niv G - ferritine peut induire une réponse immunitaire humorale *, les chercheurs ont également examiné et préparé un lot d’anticorps monoclonaux (MAB) chez des souris immunisées à la Niv G - ferritine. Parmi les 27 mabs isolés, 25 étaient efficaces pour inhiber l'infection par le pseudovirus Niv dont le virus de la stomatite furonculeuse (VSV) est le squelette et dont la concentration (CI50) nécessaire pour inhiber 50% des infections par le pseudovirus Niv est inférieure à 10 ng / ML. Une analyse de compétition épitopique a révélé que le criblage des 27 mabs obtenus pouvait identifier 4 épitopes antigéniques différents sur la protéine Niv G, dont 2 nouveaux épitopes non signalés auparavant. Enfin, les chercheurs ont évalué la réponse immunitaire induite par Niv G - ferritine et l’effet protecteur sur un modèle létal d’infection par le virus Nipah (Hamster doré syrien). L'étude a révélé que deux ou trois doses de Niv G - ferritine administrées à des hamsters produisaient du sérum actif et secondaire, et que deux ou trois inoculations pouvaient aider les hamsters à résister à 100% à une dose létale de Niv. Les chercheurs ont également examiné la teneur en ARN viral chez les hamsters vaccinés à 3 aiguilles et ont constaté qu'aucun ARN viral n'a été détecté dans les poumons, le cerveau et la rate des hamsters, suggérant que trois doses de Niv G - ferritine inhibaient la réplication du virus dans les poumons, le cerveau et la rate des hamsters.

04 méthode

Méthode de fluorescence à balayage différentiel

La stabilité thermique de la protéine cible a été déterminée par fluorimétrie à balayage différentiel (DSF) à l'aide de l'instrument PSA - 16 (Beijing berlast Technology, LLC). Diluer l'échantillon à 0,5 mg / ML et charger 20 µl de l'échantillon dilué dans un tube en verre de quartz. Les intensités de fluorescence (f) de 330 nm et 350 nm de la protéine cible sous excitation UV à 280 nm ont été mesurées dynamiquement en temps réel à une vitesse de chauffage de 1°C / min en utilisant un balayage linéaire de température de 23 à 97°c. La température du point milieu de dénaturation thermique (TM) est calculée à partir de la pente de la courbe f350nm / f330nm. Chaque échantillon est mesuré quatre fois en parallèle.

Dispersion par chromatographie d'exclusion de taille de particules avec couplage optique Multi - angle (sec - mals)

Chaque échantillon est injecté dans une colonne de chromatographie WTC - 030s5 (Wyatt Technology, Santa Barbara, ca, USA) avec un volume de 100 µl (NIV G - ferritine 0,5 mg / ML, 2 mg / ML) ml (NIV SG) et un fonctionnement isotherme de 0,5 ml / min avec 20 mmtris - hclph8,0 et 150 mmnacl en phase terminale mobile. Un détecteur mals (DAWN) ®) Et un détecteur d'indice de réfraction (RI) (Wyatt Technology, Santa Barbara, ca, USA) en série avec un détecteur UV sur le système sec. La sérum albumine bovine (BSA avec Scientific) normalise les détecteurs statiques à diffusion de lumière. La diffusion de la lumière, la mesure de l'indice de réfraction différentiel (DRI), et les molécules sont utilisées avec le logiciel Astra (6.1.2.84) (Wyatt Technology).

Test d'immunoadsorption enzymatique (ELISA)

L'antigénicité de la G - ferritine du Niv est détectée par la méthode ELISA. En termes simples, 96 - a été encapsulé avec 3 µg / ml de Niv à 4 ° C par une plaque ELISA (Corning) pendant une nuit dans un tampon de revêtement SG ou Niv G - ferritine (0,1 mcarbonate, pH 9,6). Après 1 rinçage de ces 4 derniers avec du PbS - t (PBS à 0,05% Tween 20), tous les puits ont été bloqués par 50 µl de tampon de blocage (BSA à 1% dans le PbS - t) pendant 2 h à 37°c. Post - blocage, Niv G - monomab henv - 32, henv - 26, nah1.3, antirabique virus monomab rvc20 (contrôle négatif) dilué successivement dans la plaque à partir de 5 µg / ML, incubé 4 fois à 37°c pendant 2 h avec du PbS - t, puis additionné d'un antirabique conjugué HRP l'anticorps humain IgG (dilution 1: 20000, clone ab, as002) est conservé 1 h à 37°c. La plaque est rincée avec 50 µl / puits d'une solution de coloration (ncmbiotech) monocomposant de TMB chromogène, conservée 10 - 30 min à 37°c. Le substrat réagit en ajoutant 50 µl / puits d'HCl 1m avec une Absorbance mesurée à 450 nm (od450). Pour la détection du titre lié au sérum,Auteur parLes protéines G - head de Niv - M, Niv - B, Niv - B ont été encapsulées dans HEV, layv et mojv sur une plaque ELISA, couplage HRP utilisant des IgG Anti - souris de chèvre (dilution 1: 8000, clone ab, AS003)。

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05 Résumé

Variétalement, cette étude a réussi à concevoir un nouveau candidat vaccin à nanoparticules avec le domaine de tête de la protéine Niv G comme cible antigénique, la ferritine comme plate - forme de démonstration, et à isoler un lot d'anticorps monoclonaux avec un effet thérapeutique potentiel. La recherche fournit de nouvelles perspectives pour une compréhension approfondie de l'immunogénicité de la protéine G du virus Nipah, et la Niv G - ferritine promet d'être davantage développée en tant que candidat vaccin à large spectre contre le virus hennipah, offrant de nouvelles stratégies de protection pour la sécurité de la santé publique mondiale.

Zhao Haiyan, chercheur au laboratoire national de virologie de l'Université de Wuhan, et Deng zengchin, chercheur à l'Institut de virologie de Wuhan de l'Académie chinoise des sciences, sont les co - auteurs correspondants du document. Zhou Dan, étudiant au doctorat à la faculté des sciences de la vie de l'Université de Wuhan, Cheng, diplômé en maîtrise, et Yao Yanfeng, Ph.D., expérimentateur principal à l'Institut de virologie de Wuhan de l'Académie chinoise des sciences, sont les co - premiers auteurs de la thèse.

L'étude a été financée par le programme national de recherche et développement, le Programme des jeunes talents de la Commission de la santé de la province du Hubei et le Programme des talents de l'Académie chinoise des sciences, avec le soutien du laboratoire national de biosécurité de Wuhan et du laboratoire national de virologie de Wuhan.

Lien vers l'original: https://www.nature.com/articles/s41541-024-00954-5

L'analyse de la stabilité thermique du Niv G - ferritine et du Niv SG par le principe de la fluorimétrie à balayage différentiel (DSF) à l'aide de l'analyseur de stabilité des protéines PSA - 16, développé indépendamment par berlast Technology Co., LLC de Beijing, a montré que le Niv G - ferritine et le Niv SG présentaient une stabilité thermique similaire avec un TM de ~ 65 ° C, indiquant que la fusion du Niv G et du ferritine n'avait pas d'effet significatif sur leur stabilité structurelle.