Les chercheurs de l'Institut de recherche biologique de l'Université Industrielle de Qilu (Académie des sciences de la province du Shandong) ont publié un article intitulé "Structural - guided high stable fusion Urate Oxidase Engineering to self - assembly with Cellulase Modified Electrode for enhanced Uric Acid Sensing" dans la revue International Journal of Biological Macromolecules en avril 2025.

Xingbao Wang, Weili Gong, Yunlong Xue, Yi Yu, Xiaozhen

Huang, Yue Shao, Xuan Li, Xin Wang, Chunyu Song, Binglian

Wang, Lihe Zhang, Yaohong Ma

PII: S0141-8130(25)04227-8

La stabilité thermique de la protéine se réfère à la capacité de transformation de la chaîne polypeptidique de la protéine sous l'influence de la température, qui se manifeste principalement par des changements dans les caractéristiques chimiques et la conformation spatiale de la chaîne polypeptidique lorsque la température change, plus le changement est faible, plus la stabilité thermique est élevée. La stabilité thermique des protéines est influencée par différents facteurs externes tels que la température, le pH, la Force ionique, etc. et revêt une grande importance dans des domaines tels que la biotechnologie, la recherche et le développement de médicaments, ainsi que l'industrie alimentaire.

La température de dénaturation des protéines est un concept important pour les biologistes qui étudient la stabilité thermique des protéines, c'est - à - dire lorsqu'une protéine subit une chaleur lorsque sa structure change et que la protéine passe d'une structure tridimensionnelle stable à une structure désordonnée lâche. La stabilité thermique d'une protéine est généralement exprimée en utilisant la température de fusion (TM, également appelée température de dénaturation thermique), c'est - à - dire la température à laquelle la protéine se replie à 50%.

01 Préface

La stabilité élevée et la rétention de l'activité catalytique de l'URATE OXYDASE immobilisée (uox) sont essentielles pour obtenir un capteur précis d'acide urique (UA). Cette étude a mis au point un biocapteur électrochimique de l'UA basé sur l'uox fixé auto - Assemblé qui facilite la détection de l'UA par fusion d'un module de liaison aux glucides (CBM) sur une électrode modifiée en Cellulose. La stabilité structurale de la fusion cbm3 n - terminale a été démontrée supérieure à celle de la fusion cbm3 ou cbm2 C - terminale à l'aide de stratégies d'ingénierie enzymatique axées sur la structure computationnelle. La suppression supplémentaire du résidu n - terminal cbm3 (p2vsg5) et du résidu de la région de jonction (k158epmsn163), prédit nuisible à la stabilité de la structure cbm3 - uox, a conduit à la construction de cbm3 - Δ10aa - uox, ce qui améliore considérablement la fiabilité du biocapteur UA par rapport au biocapteur uox réticulé au Glutaraldéhyde (0 - 0375 mm, 5 jours), présentant une relation linéaire dans la gamme UA de 0 à 0625 mm, R2 > 0.99， Peut durer 20 jours. En outre, par coimmobilisation de l'uox sauvage et du cbm3 - Δ10aa - uox (0 - 0875 mm, > 34 jours, R2 > 0.99）， Le mécanisme par lequel les uox fusionnés augmentent le courant au cours de la phase initiale a été étudié et attribué à l'interaction entre les sous - unités uox et à la rupture du peptide de liaison, démontrant en outre que la stabilité accrue du peptide de liaison cbm3 - Δ10aa - uox prolonge le processus d'augmentation du courant et améliore La durée de vie utile. Cette étude souligne l'efficacité de l'immobilisation auto - Assemblée pour faire progresser le domaine des biocapteurs et fournit une stratégie robuste pour l'évolution de biocapteurs multimériques similaires.

02 Résumé

L'acide urique (UA), un composé azoté clé largement présent dans les fluides d'organismes tels que le sérum et l'urine, est le principal produit final du métabolisme des purines. Les taux normaux d'UA dans le sérum d'un individu sain sont d'environ 0,21 - 0,43 mm chez l'homme adulte et de 0,15 - 0,36 mm chez la femme adulte, respectivement, tandis que chez les patients atteints de goutte, les concentrations d'UA peuvent atteindre 1,49 - 4,46 MM. Les anomalies des taux d'UA dans les fluides de l'organisme peuvent suggérer des maladies telles que la goutte, le syndrome métabolique et les maladies rénales, ce qui en fait un Biomarqueur utile pour détecter les maladies liées au métabolisme des purines. Par conséquent, la détection rapide et fiable de l'UA dans les fluides d'un organisme est souvent essentielle à son diagnostic et à son traitement.

À l'heure actuelle, un certain nombre de méthodes de détermination de l'UA ont été développées, y compris la chromatographie liquide à haute performance (HPLC), la spectrophotométrie, la chromatographie ionique, la spectrométrie de masse à dilution isotopique / HPLC (ID - MS) et les méthodes de biosense électrochimiques. Parmi ces méthodes, les biocapteurs enzymatiques de type courant basés sur la catalyse redox de l'URATE OXYDASE (uox ou uridase, EC 1.7.3.3) ont fait l'objet de recherches approfondies en raison de leur simplicité, de leur sensibilité, de leur spécificité et de leur réponse rapide. L'équation de la réaction uox est la suivante: UA + 2H2O + O2 allantoïne + H2O2 + CO2. Au cours de la détection biologique, l'uox fixé sur l'électrode réagit avec l'UA, consomme de l'O2 et produit de l'H2O2. Le O2 réduit ou le H2O2 oxydé est proportionnel à la concentration en UA et le signal oxydé ou réduit peut être converti et amplifié en un signal physique lisible par transducteurs et amplificateurs électroniques. La stabilité élevée de l'uox immobilisé et l'activité catalytique maintenue sont donc essentielles pour obtenir une détection précise de l'UA.

Dans les études précédemment rapportées, les biocapteurs UA de type courant ont été construits en utilisant différents types de techniques d'immobilisation enzymatique. Les méthodes d'adsorption physique et d'encapsulation sont couramment utilisées pour l'immobilisation de l'uox, mais leur processus d'adsorption a une force de liaison faible et est vulnérable aux changements environnementaux, ce qui réduit la stabilité de fonctionnement et de stockage des biocapteurs correspondants. L'encapsulation uox est généralement réalisée à l'aide de polymères tels que la Polyaniline (PANI) et le Polypyrrole. Cependant, les fuites d'enzymes immobilisées de ces polymères peuvent affecter leur stabilité. Les méthodes de liaison covalente et de réticulation utilisant des agents bifonctionnels tels que le glutaraldéhyde ou le carbodiimide pour former une liaison covalente stable entre l'enzyme et le support ou la sérum albumine bovine (BSA) sont également des méthodes couramment utilisées pour fixer chimiquement l'uox, ce qui évite la désorption et les fuites de l'enzyme. Cependant, l'inactivation enzymatique généralisée et la faible répétabilité induite par la méthode de liaison covalente limitent son utilisation dans les biocapteurs. Plus récemment, la méthode d'adsorption par affinité s'est révélée être une stratégie prometteuse d'immobilisation enzymatique qui améliore les performances des biocapteurs enzymatiques. De plus, le module de liaison aux glucides (cbm2) de la famille 2 a été fusionné par génie génétique avec la glucose oxydase pour promouvoir les propriétés de détection du glucose. Cependant, la structure et le mécanisme catalytique de l'uox sont différents de ceux de la glucose oxydase, il reste donc essentiel d'explorer la construction d'uox stables et actifs fusionnés au CBM en tant qu'éléments biosensoriels de l'UA.

L'uox est une structure fonctionnelle en forme de tonneau tétramérique dont les sites actifs sont formés par des résidus interfaciaux provenant de deux monomères. Chaque monomère contient deux domaines identiques avec une structure supersecondaire anti - parallèle ββαββ, appelée domaine de pliage tunnel. Certaines interactions faibles (liaisons non covalentes, liaisons secondaires), y compris les forces de Van der Waals, les liaisons hydrogène, les liaisons sel (liaisons de dissociation) et les interactions hydrophobes, participent à la stabilisation des structures quaternaires. De plus, la disposition complémentaire des groupes polaires et hydrophobes à l'interface intime formée entre les sous - groupes favorise l'Association de sous - groupes spécifiques. Au cours de la catalyse uox, l'utilisation d'une approche sans Cofacteur pour promouvoir et contrôler la chimie de l'O2 a proposé différents mécanismes catalytiques similaires aux oxydases dépendantes de la flavine ou aux monooxygénases dépendantes de la flavine, mais leur mécanisme d'action n'a pas été élucidé. En raison de l'activité catalytique Multi - dépendante de l'uox et des mécanismes catalytiques ambigus, moins de recherches ont été rapportées sur l'amélioration des performances de l'uox au cours des dernières décennies. La construction d'un uox stable de fusion génétique est donc un défi majeur.

La fusion en tandem est une stratégie populaire et viable pour construire des protéines de fusion synthétiques. Lors de l'utilisation de cette stratégie pour obtenir la protéine de fusion idéale, deux éléments doivent être soigneusement pris en compte: l'ordre optimal de placement des domaines entre les partenaires de fusion et la sélection de joncteurs appropriés pour lier les domaines protéiques ensemble. La conception aveugle d'une protéine de fusion peut entraîner une variété de conséquences indésirables, notamment un mauvais pliage du domaine, une faible production de protéines et une diminution de l'activité biologique. Grâce au développement remarquable de programmes de calcul spécialisés dans la prédiction de la structure des protéines et la conception rationnelle des protéines, tels que alphafold2, procheck, autodock Vina et gromacs, il est possible de mieux comprendre la structure des protéines de fusion et d'éviter de nombreux résultats indésirables.

03 résultats

Pour une caractérisation structurelle plus complète de tous les uox,AuteurLa détermination de la stabilité thermique a été effectuée par fluorescence différentielle à balayage (DSF) [34]. Comme le montre la figure S7, les pics de uox - cbm3 et uox - cbm2 sont plus asymétriques, en particulier uox - cbm2, ce qui suggère que la rupture de CBM et uox induit une dénaturation synergique de plusieurs domaines. En revanche, le pic DSF le plus symétrique et le plus étroit de cbm3 - Δ10aa - uox a validé sa stabilité structurale, ce qui est conforme aux résultats des simulations de dynamique moléculaire et des analyses SDS - page.

04 méthode

La stabilité thermique de la protéine cible a été évaluée à l'aide d'un analyseur de stabilité de la protéine PSA - 16 fabriqué par Beijing berlast Technology, LLC. L'échantillon est d'abord dilué à une concentration de 0,5 mg / ML. L'échantillon dilué de 20 µl est ensuite placé dans un tube en verre de quartz (numéro de produit LG - 002, également de Beijing berlast Technology LLC).

L'intensité de fluorescence des protéines endogènes à 330 nm et 350 nm a été mesurée par balayage linéaire de la température. La température varie de 23 à 97 °C et la vitesse de montée en température est de 1 °C par minute. La température médiane de dénaturation thermique (TM) a été calculée à partir de la pente de la courbe f350 / f330. Les mesures ont été répétées quatre fois pour chaque échantillon.

05 résultats

Dans cette étude, les auteurs ont construit une série d'uréates oxydases de fusion CBM à l'aide d'une stratégie d'ingénierie enzymatique guidée par la structure et ont exploré les facteurs clés qui influent sur la stabilité de l'uox de fusion en tant qu'élément de détection biologique, ce qui suggère un rôle clé dans la stabilité structurale de L'uox de fusion CBM par le résidu continu n - terminal cbm3 (P2, V3, S4, G5) et la région d'ancrage interdomaine en position 158 à 163 (k158epmsn163). Après la suppression des résidus instables, la fiabilité du biocapteur UA est considérablement améliorée. Cette étude a contribué à la construction rationnelle d'uox fusionnés avec des propriétés réglables et prévisibles et a fourni un candidat idéal pour la fabrication d'excellents biocapteurs UA.

Pour une caractérisation structurelle plus complète de tous les uox,AuteurLa détermination de la stabilité thermique a été effectuée par fluorescence différentielle à balayage (DSF) [34]. Comme le montre la figure S7, les pics de uox - cbm3 et uox - cbm2 sont plus dissymétriques, en particulier uox - cbm2, ce qui indique une dénaturation synergique de plusieurs domaines due à la fracture de CBM et uox. En revanche, le pic de fluorescence différentielle à balayage (DSF) de cbm3 - Δ10aa - uox est le plus symétrique et le plus étroit, ce qui confirme sa stabilité structurelle, comme le montrent les simulations de dynamique moléculaire (MD) et les analyses par électrophorèse sur gel de dodécyl * - Polyacrylamide (SDS - page).