Étude de co - culture en tandem intestin - foie organoïdes absorption de médicaments et processus toxiques

Afin de combler les limites des modèles animaux, de nouveaux modèles d'évaluation de l'innocuité des médicaments ont été proposés * et les modèles existants ont été réduits. Afin de simuler l'absorption et le métabolisme des médicaments dans le système microphysiologique intestin - foie (MPS) in vitro et de prédire les effets pharmacocinétiques et toxiques, l'Institut d'évaluation de la sécurité de l'Institut chinois d'examen des aliments et des médicaments (Centre national de surveillance de l'évaluation de la sécurité des médicaments), L'Académie chinoise des sciences médicales et l'École de médecine Concorde de Beijing, les scientifiques de la société allemande tissuse GmbH ont collaboré pour établir une puce de culture en tandem intestin - foie qui a détecté le processus de lésions hépatiques aiguës après un surdosage d'APAP (acétaminophène),Et publié dans la revue Food and Chemical Toxicology en septembre 2024.

Des organoïdes intestinaux ont été établis à l'aide des lignées cellulaires Caco - 2 et HT29 - MTX - E12, tandis que des organoïdes hépatiques ont été établis à l'aide de HepG2, HUVEC - T1 et THP - 1 induits par PMA, ainsi que des astrocytes hépatiques humains. La concentration en APAP a été déterminée par chromatographie liquide à haute performance et les paramètres pharmacocinétiques ont été ajustés par analyse non auriculaire à l'aide du logiciel Phoenix. Des changements dans les biomarqueurs des lésions hépatiques, l'aspartate aminotransférase et l'alanine aminotransférase, ainsi que dans le marqueur fonctionnel du foie, l'albumine, ont montré que les cultures à court terme de ces deux modèles de puces d'organes étaient stables sur une période de 4 jours. Après l'administration d'acétaminophène (APAP), la signalisation de l'oxygène actif est augmentée, tandis que le potentiel de la membrane mitochondriale diminue, la caspase - 3 (cystéine Aspartate protéase - 3) est activée et la signalisation p53 est augmentée, ce qui indique qu'un excès d'APAP déclenche une réaction toxique. Dans un modèle de système multi - organes entéro - hépatique, nous avons ajusté les paramètres Toxicocinétiques et modélisé le processus de toxicité hépatique après un surdosage d'APAP, ce qui facilitera l'utilisation de puces d'organes dans la détection de la toxicité des médicaments.

1. Introduction

Les lésions hépatiques médicamenteuses (IDI) sont un obstacle majeur à la recherche et au développement de médicaments et entraînent le retrait du marché des médicaments (2021; 2016). Les différences entre les modèles animaux et les humains et les exigences éthiques de plus en plus strictes ont rendu nécessaire l’adoption d’un nouveau modèle d’évaluation de la sécurité des médicaments (2014). Ce système microphysiologique (MPS), également appelé « Organe sur puce», est un dispositif construit en combinant la microfluidique, la microfabrication et la culture cellulaire tridimensionnelle (3d). Il est capable de reproduire des fonctions organiques physiologiquement pertinentes pour des modèles animaux. La plateforme MPS est un environnement physiologique miniaturisé in vitro (Shinohara et al., 2021).

Cela permet de simuler et de contrôler avec précision les gradients chimiques et les forces biodynamiques pour simuler l'environnement in vivo et y répondre. Les canaux microfluidiques prédéfinis agissent comme des vaisseaux sanguins conçus, recréent la fonction des tissus physiologiques in vivo (Low et al., 2020) et permettent l’association avec d’autres systèmes Multi - organes (kulthong et al., 2020). De plus, les systèmes Multi - organes permettent une surveillance fonctionnelle des tissus en temps réel (Milani et al., 2022).

Un modèle de puce Multi - organes couplé par microcanaux est capable de modéliser davantage les réactions dynamiques humaines et les interactions organiques internes (Arakawa et al., 2020) et de fournir des preuves supplémentaires de la relation entre l'exposition aux médicaments et l'effet / toxicité des médicaments. L'intestin et le foie sont les principaux organes d'absorption, de distribution, de métabolisme et d'excrétion (ADME) et sont donc importants dans les études pharmacocinétiques (PK) (Vernetti et al., 2017).

Les médicaments oraux sont absorbés directement dans la circulation sanguine par le tube digestif et les intestins, ce qui affecte la biodisponibilité et la dose systémique du médicament. Les modèles de puces intestinales peuvent simuler l’absorption de médicaments et représenter les concentrations ADME et sanguines des médicaments (Milani et al., 2022). Lee et al. (2017) ont construit une puce intestino - hépatique tridimensionnelle pour représenter un modèle pharmacocinétique de l’acétaminophène (APAP), tandis qu’arakawa et al. (2020) ont construit un modèle intestino - hépatique pour l’extrapolation quantitative in vitro du métabolisme continu du San - zolam. Milani et al. (2022) ont évalué la quantité de précurseur du médicament, le mycophénolate mofétil, produite en raison du métabolisme intestinal et hépatique du mycophénolate mofétil mofétil. Par conséquent, des méthodes similaires peuvent être appliquées à d'autres MPS Multi - organes pour étudier les processus pharmacodynamiques dans le corps humain.

À l'heure actuelle, seuls quelques exemples de systèmes à puce Multi - organes qui effectuent simultanément des tests de toxicité et l'identification des échantillons ont été rapportés. Liu et al. (2020) ont étudié l'absorption, le métabolisme et la toxicité du complexe de ginsénosides K sur la base d'un système de puces Multi - organes à base de puces intestinales, vasculaires, hépatiques et rénales. Jeon et al. (2021) ont rapporté une puce entéro - hépatique qui reproduit l'absorption des acides gras et l'accumulation ultérieure de lipides dans le foie.

Pour explorer le système microphysiologique intestin - foie in vitro, nous avons développé ici une puce d'organe diptyque intestin - foie reproductible en concaténant des cultures intestinales avec des sphéroïdes hépatiques 3D construits à l'aide de quatre lignées cellulaires sur une puce d'organe diptyque (2oc). Nous avons disséqué la fonction de la puce en détectant les niveaux de biomarqueurs fonctionnels et de protéines, puis testé la toxicité hépatique dans la puce en ajoutant un composé hépatotoxique appelé acétaminophène (APAP) à la Chambre intestinale pour simuler la toxicité hépatique après absorption du médicament. Après 48 heures d'incubation, la distribution du médicament et les signaux de toxicité hépatique ont été détectés dans les deux chambres.

2 matériaux et méthodes

2.1. Cellules et cultures ressources cellulaires et méthodes de culture voir informations supplémentaires.

2.2. Culture des intestins

Pour construire un modèle intestinal sur des plaques de culture transwell, les cellules Caco - 2 ont été ensemencées dans des plaques de culture transwell (Merck, pihp01250) à une densité de 1 x 10 - 6 cellules / puits. Les cellules Caco - 2 et HT29 - MTX - E12 ont été mélangées dans un rapport de 9: 1 et ensemencées dans chaque plaque de culture à la même concentration. Le milieu est changé tous les deux jours du jour 0 au jour 7 et tous les jours après le jour 7.

2.3. Culture en 3D (foie)

Sur la base de notre étude précédente (Sun et al., 2024), les cellules THP - 1 ont été diluées à 5 x 10 - 5 cellules / ML dans du milieu rpmi 1640, puis traitées pendant 48 heures par 25 nanomoles d'acide phorboesteroyl acétique (PMA, medchemexpress) dans des plaques 6 puits. Les cellules THP - 1 induites par le PMA sont ensuite récoltées par culture dans le milieu pendant 24 heures et criblage avec tryple (Gibco). 2 HepG2、 Les cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine T1, THP - 1, ainsi que les cellules stellaires du foie humain (hhsc) ont été recueillies après digestion et la suspension cellulaire a été mélangée dans un rapport de 60: 19: 15: 6. Pour former un nombre égal de cellules, 100 cellules par puits ont été ensemencées après dilution dans une plaque 96 puits à fond rond de type U à faible paroi (Shenzhen Liver Biotechnology Co., Ltd., LV - ula002 - 96uw). Changez la moitié du milieu tous les deux jours. Les Morphologies sphériques ont été observées et mesurées à l'aide d'un analyseur d'imagerie cellulaire à haute connotation (Perkin Elmer, série opretta).

2.4. Co - culture intestin - foie à base de puces

Les plaques humimic chip2 24 puits (tissuse GmbH, Allemagne) ont été préparées selon le protocole recommandé (Wagner et al., 2013). Le 14e jour après l'établissement du modèle intestinal, des inlays cellulaires transwell ont été ajoutés à une chambre de culture de 24 puits et 50 sphères à une chambre de culture de 96 puits pour former un modèle de puce intestin - foie.

Selon la méthode précédente (Lin et al., 2020), la co - culture a été réalisée dans un cycle de microcanaux 2oc en utilisant 600 µl de milieu circulant et 400 µl de milieu situé au Sommet de la barrière.

Le milieu de culture dans la Chambre du foie est changé une fois par jour et la moitié du surnageant circulant est collecté et remplacé. A l'issue des 7 jours de co - culture, les marqueurs fonctionnels organo - spécifiques du foie ont été analysés par immunofluorescence. Réglez la pompe à microflux sur puce à une fréquence de 0,8 Hz.

2.5. Intégrité des organoïdes intestinaux

La résistance trans - endothéliale (teer) et le coefficient de perméabilité apparente intestinale (PAPP) de la fluorescéine sodique et de l'isothiocyanate fluorescéine - Dextrane Fluorescent de 40 kDa ont été mesurés à différents moments pour évaluer l'intégrité des organoïdes intestinaux. Méthodes voir informations supplémentaires.

2.6. Évaluation de la performance des organoïdes du foie

Dans un modèle de foie, un test sensible de viabilité cellulaire fluorescente bicolore a été choisi pour distinguer les cellules vivantes des cellules mortes. La fluorescéine am jaune calcique (un colorant perméable aux cellules) a été utilisée comme marqueur de cellules vivantes et le Bobo - 3 iodé (Invitrogen Corporation) comme marqueur de cellules mortes. Les composants cellulaires vivants produisent une Fluorescence verte intense et uniforme (excitation / émission 488 nm / 515 nm) dans les cellules vivantes et les composants cellulaires morts produisent principalement une Fluorescence rouge du noyau (excitation / émission 570 nm / 602 nm). Divers biomarqueurs ont été mesurés dans le surnageant obtenu à l'aide d'un modèle établi de puce d'organe hépatique. Nous avons évalué les niveaux d'albumine (ALb), d'urée (Urea), d'aspartate aminotransférase (AST) et d'alanine aminotransférase (ALT), qui sont des indicateurs du métabolisme et des lésions hépatiques. La teneur en adénosine triphosphate (ATP) a été mesurée à l'aide du cell Titor GLO 3D (promega) selon les instructions du fabricant. La cholacyl - Lysine - fluorescéine (clf) est un acide biliaire marqué à la fluorescéine dont le comportement biologique est très similaire à celui de la cholacyl - glycine naturelle. Pour visualiser les canaux biliaires dans un modèle tridimensionnel du foie, nous avons préparé 20 micromoles de réserve de clf et incubé le modèle à 37°c pendant 2 heures. Coloration avec Hoechst 33342 et incubation pendant 10 minutes. Les cellules sont rincées trois fois avec du milieu rouge sans phénol et le signal de fluorescence est détecté à une longueur d'onde d'excitation / émission de 498 / 517 nanomètres.

2.7. Morphologie et immunocoloration

Comme mentionné précédemment (Sun et al., 2024), des tranches égales d'intestin et de foie ont été fixées avec du paraformaldéhyde et déshydratées avec une solution de saccharose. Les coupes congelées ont été préalablement découpées par coloration à l'hématoxyline - Érythorne (he), à l'acide periodique - Schiff (pas) ou par immunocoloration avant coloration. Pour l'immunocoloration, les coupes sont d'abord rincées au PBS trois fois pour traiter les cellules avec du PBS contenant 0,5% de Triton X - 100 (solbo), le temps de traitement et le traitement de perforation sont de 10 minutes et fermées avec du sérum de chèvre (beyotime Biotechnology) pendant 30 minutes à température ambiante. On ajoute un antigène topique dans chaque puits à une certaine dilution selon les instructions et on incube une nuit à 4°C. L'un des antigènes topiques suivants a été utilisé: anti - occludine (91131s, CST, dilution 1: 400), anti - Zo - 1 (ab221547, abcam, dilution 1: 100), anti - mrp2 (ab172630, abcam, dilution 1: 500) et anti - PGP (numéro de produit 25081 - 2 - AP, proteintech, dilution 1: 500). Les cellules ont été lavées, traitées avec le diptène Fluorescent correspondent et co - localisées avec dapi (beyotime Biotechnology). Les Morphologies et les coupes de champ clair sont observées à l'aide d'un analyseur d'imagerie cellulaire à haute connotation ou d'un microscope (Olympus IX71). Pour la coloration immunofluorescente in situ, la membrane intestinale et les modèles hépatiques 3D ont été rincés trois fois avec du PBS et fixés avec du paraformaldéhyde à 4% pendant 30 minutes. Ensuite, les échantillons ont été perforés dans du PBS contenant 0,5% de Triton X - 100 (solbo) pendant 10 minutes et fermés avec du sérum de chèvre (beyotime Biotechnology) pendant 30 minutes à température ambiante. L'anticorps in situ dilué est ajouté dans chaque puits à une certaine dilution selon les instructions et incubé une nuit à 4°C. Les anticorps in situ utilisés sont: anti - occludin (91131s, CST, dilution 1: 400), anti - Zo - 1 (SC - 33725, Santa Cruz Biotechnology, dilution 1: 500), anti - mrp2 (ab172630, abcam, dilution 1: 500), anti - ABCB11 / bsep (ab255605, abcam, dilution 1: 100), anti - PGP (CAT No. 25081 - 2 - AP, proteintech, dilution 1: 500), anti - CYP3A4 (MA5 - 17064, thermofisher, dilution 1: 1000), anti - GPP (CAT No.Anti - Ki67 (9449s, CST, dilution 1: 10000), Anti - CD31 (3528s, CST, dilution 1: 10000), anti - cd68 (ab213363, abcam, dilution 1: 10000), anti - SMA (14395 - 1 - AP, proteintech, dilution 1: 10000), anti - craquage caspase - 3 (9664s, CST, dilution 1: 4000) et anti - p53 (2524s, CST, dilution 1: 20000). Les cellules sont lavées, incubées avec des anticorps secondaires couplés par fluorescence et co - localisées avec dapi (beyotime Biotechnology). Les anticorps secondaires utilisés sont: Goat anti - rabbit IgG h & L (Alexa fluor ® 488) (ab150077, abcam, dilution 1: 1000), IgG Anti - souris de chèvre (H + l) (Alexa fluor ® 555 Conjugate) (4417, CST, dilution 1: 1000) et Goat anti - souris IgG h & L (Alexa fluor ® 488) (ab150113, abcam, dilution 1: 1000). Les résultats ont été évalués par analyse de contenu élevé et Microscopie à fluorescence.

2.8. Détermination de la toxicité des médicaments et de la viabilité cellulaire

Comme mentionné précédemment (Sun et al., 2024), la viabilité cellulaire a été détectée à l'aide de cell Titor GLO et la viabilité cellulaire et la survie cellulaire (%) ont été déterminées. Inoculation des cellules dans des plaques 96 puits à une densité de 1 x 10 - 4 cellules / puits dans des plaques 96 puits; Le surnageant est éliminé le lendemain et cultivé avec de l'acétaminophène (4 mmoles). La survie des sphères est déterminée en utilisant la même méthode. Cette détection est réalisée à l'aide d'un photomètre.

2.9. Processus oral simulé d'aspirine dans une puce de co - culture

7 modèles 2oc ont été chargés, 4 microcanaux ont administré de l'acétaminophène (APAP) et le reste du circuit n'a pas été administré. Pour simuler le processus oral ainsi que les conséquences hépatotoxiques induites par l'APAP, 400 µl d'APAP à 10 mmoles ont été ajoutés en tête de l'insert le lendemain du chargement de la boucle 2oc. On recueille 10 µl de surnageant à 0, 0,5, 1, 2, 4, 8, 24, 32 et 48 heures respectivement pour analyse quantitative par chromatographie liquide. 48 heures après l'administration, le surnageant est recueilli pour la mesure de différents biomarqueurs afin d'évaluer la résistance transdermique (teer). Des sphéroïdes hépatiques sont également collectés pour l'évaluation de la toxicité hépatique. Nous avons également recueilli au moins 3 - 5 pour la détermination de la viabilité cellulaire et le reste a été transféré dans des plaques de 96 puits pour la conservation pour la coloration fluorescente.

2.10. Évaluation de la toxicité hépatique des puces de Coculture

La viabilité cellulaire ainsi que les taux d'albumine (ALb), d'aspartate aminotransférase (AST) et d'alanine aminotransférase (ALT) ont été mesurés selon le Protocole de trousse recommandé pour évaluer les lésions hépatiques 48 heures après l'administration du médicament. La détermination du potentiel de membrane mitochondriale a été réalisée à l'aide d'un kit de détection du potentiel de membrane mitochondriale (beyotime Biotechnology, c2001s). Un modèle 3D de foie enveloppé de la puce 2oc a été transféré dans une plaque de 96 puits. Les signaux de fluorescence du tétraméthylrhodamine éthyl ester (tmre) et du Hoechst 33342 ont été détectés respectivement à EX / em = 550 / 575 et 350 / 461 nanomètres. Le stress oxydatif a été déterminé à l'aide du réactif de stress oxydatif cellrox (symerfishell Technology, c10444). Un modèle de foie 3D embarqué de la puce 2oc a été transféré dans une plaque 96 puits. Les signaux de fluorescence de cellrox et Hoechst 33342 ont été détectés respectivement à 485 / 520 nm et 350 / 461 nm. Le Ki - 67 in situ, la caspase - 3 lysée et la signalisation p53 ont été détectés par immunofluorescence pour évaluer la capacité de prolifération cellulaire et le Profil d'apoptose.

2.11. Quantification des échantillons

Sur la base de la méthode précédente (marin et al., 2019), la concentration en paracétamol (APAP) a été mesurée par chromatographie liquide à haute performance (HPLC) (Shimazu, LC - 2040c 3D). La Chambre basale (Chambre du foie) est remplie de milieu frais, tandis que la chambre supérieure est exposée au milieu acétaminophène. À chaque moment, prélever un échantillon de 10 µl de chaque côté, comme décrit à la section 2.9. Le méthanol est choisi comme agent précipitant des protéines et le précipité est éliminé par centrifugation (13000 tr / min, 4°C, 15 min) après addition de 30 µl de méthanol pour précipiter les protéines. On utilise une colonne de chromatographie C18 inerte et durable (longueur 150 mm, diamètre intérieur 4,6 mm, granulométrie 5 microns, Shimazu). On utilise deux phases mobiles: le solvant a (méthanol) et le solvant B (eau distillée) avec un débit de 0,8 ml / min. La composition du solvant est de 5% a en 0 - 4 min, 5 - 100% a en 4,01 - 10 min et 5% a en 10,01 - 15 min. L'apport est de 10 µl et la détection utilise un détecteur à matrice de photodiodes (PDA) (longueur d'onde 280 nm). La concentration en acétaminophène est déterminée à l'aide d'une courbe standard. Les paramètres pharmacocinétiques ont été ajustés dans Phoenix winnonlin (certara, États - Unis) à l'aide d'un modèle non atrio - ventriculaire (NCA). En utilisant la méthode d'interpolation linéaire trapézoïdale linéaire comme méthode de calcul, le type de modèle est défini comme plasmatique et l'option de dose comme extravasculaire. Les données de concentration - temps d'acétaminophène (APAP) dans le compartiment hépatique, déterminées par chromatographie liquide à haute performance, ont été ajustées pour déterminer l'aire sous la courbe (AUC) de 0 à 48 heures. La concentration de pointe (cmax) et le temps de crête (Tmax) sont lus directement à partir de la courbe de concentration individuelle par rapport au temps (Higher, 2022; Wang et al., 2022). Les signaux de napqi ont été détectés par chromatographie liquide ultra haute performance - spectrométrie de masse en tandem (UPLC - MS) (Zhang et al., 2018). Une solution mère de concentration 1 mg / ML est préparée en dissolvant la n - Acétyl téréphtalène imine (napqi) (MCE, HY - 66005) dans du méthanol et diluée à nouveau avec du méthanol jusqu'à une solution de travail de 1 µg / ML. La formation de napqi a été analysée. La détection a été effectuée par chromatographie liquide ultra haute performance - spectrométrie de masse (UPLC - MS) équipée du système AC LC AB sciex, d'un détecteur PDA et d'un instrument triple quadripôle 6600 +, 0,5, 1, 2, 4, 8, 24, 32 et 48 heures après l'administration d'acétaminophène (APAP). La séparation chromatographique a été réalisée en utilisant une colonne de chromatographie Waters acquity UPLC beh C18 (2,1 mm x 50 mm). 1,7 microns). Les éluants utilisés sont (A) une solution aqueuse d'acide formique à 0,1% (en volume) et (b) du méthanol, séparés par une procédure d'élution en gradient, comme indiqué dans le tableau S1. Le débit de chromatographie liquide ultra - haute performance est de 0,3 ml / min et l'analyse par chromatographie liquide ultra - haute performance - spectrométrie de masse utilise un échantillon de 10 µl. Les couples d'ions correspondent au potentiel de dépolymérisation, à l'énergie de collision, à la distribution de l'énergie de collision et à la température sont caractérisés par M / z 149,98 - 108,04 (30, 30, 15 et 350), correspondent au napqi.

2.12. Analyse statistique

Les variables continues sont exprimées en moyenne ± écart - type. Un test T d'étudiant à deux queues a été utilisé pour étudier les différences entre deux échantillons indépendants. L'analyse des données a été réalisée à l'aide d'IBM SPSS Statistics version 25 (IBM Corporation). Le modèle de régression linéaire a été réalisé avec SPSS et graphpad Prism 7.00 (logiciel graphpad). La signification statistique a été fixée à P ≤ 0,05.

3. Résultats

3.1. Culture des organoïdes

Le mélange cellulaire a été ensemencé dans des plaques de culture transwell à des densités de 1 x 10 - 6, 5 x 10 - 5 et 2,5 x 10 - 5 cellules / puits pour obtenir un modèle intestinal in vitro. La résistance transépithéliale (teer) a atteint 300 Ω cm 2 en 21 jours dans tous les groupes, le Groupe de co - culture haute densité atteignant 300 Ω cm 2 en 12 jours (figure 1a). Au jour 14, le sodium fluorescéine et le Dextrane fluorescéine dans un modèle de cohorte de co - culture à haute densité satisfont aux exigences du test de perméabilité (figure 1B). La monocouche de Caco - 2 peut être considérée comme complète lorsque la résistance transépithéliale atteint 200 - 1000 Ω cm2 (Iftikhar et al., 2020). Dans des expériences ultérieures, des groupes de co - culture à haute densité ont été sélectionnés pour former une barrière intestinale. Les protéines de liaison étroite occludine et zo - 1 ont été colorées pour montrer leur intégrité dans les conditions de culture des équivalents intestinaux. Aux jours 7 et 21, nous observons la structure du réseau continu de l'occludine (Figure 1c), tandis que dans les tranches des jours 14 et 21, l'occludine et la zo - 1 sont réticulées (figure 1D, figure s1a), ce qui indique que la barrière intestinale est considérée comme intacte au jour 14. Aux jours 14 et 21, les transporteurs mrp2 et PGP sont répartis sur un côté de la tranche intestinale (figure 1e, figure s1b), indiquant la polarité du modèle intestinal. Globalement, les résultats montrent que les équivalents intestinaux obtenus au jour 14 sont étroitement liés et polaires; Par conséquent, au jour 14, la barrière intestinale est considérée comme mature et utilisée pour d'autres expériences. Sur la Figure 2A, le diamètre du modèle augmente rapidement en 10 jours et se stabilise à environ 400 microns. La coloration He n'a montré aucun noyau nécrotique significatif au jour 7 (Figure 2B), mais un noyau nécrotique léger ou plusieurs apoptoses au jour 10 (Figure 2B) et une région nécrotique centrale sévère au jour 14 (figure s1i). Conformément à la distribution des cellules mortes illustrée par la coloration des cellules vivantes / mortes (figure 2c), davantage de cellules mortes ont été détectées au jour 10. La quantité totale d'ATP dans le modèle a continué d'augmenter (figure s1c), tandis que la sécrétion de lactate déshydrogénase (LDH) n'a pas augmenté de manière significative (figure s1d). Le modèle s'est développé de manière stable, le nombre de cellules nécrotiques a augmenté avec le temps de culture prolongé et les cellules nécrotiques internes n'ont pas pu être détectées en détectant les niveaux de LDH dans le surnageant. Pour éviter la formation de noyaux nécrotiques, ces résultats indiquent une durée de culture limitée à 7 jours. Les signaux de fluorescence des cellules endothéliales veineuses ombilicales humaines T1 (HUVEC - T1), des macrophages alvéolaires humains THP - 1 et des cellules stellaires hépatiques humaines hhsc ont été suivis par coloration immunofluorescente au jour 7 (figure 2d) et au jour 10, respectivement par les signaux CD31, cd68 et alpha - SMA.

La figure s1g montre que les trois types cellulaires ci - dessus sont encore présents dans la sphère au jour 10.Les transporteurs mrp2, PGP et bsep ont été détectés au jour 7 (figure 2e) et la fonction de l'Efflux d'acides biliaires a été suivie par la sonde fluorescente clf (figure s1h). Le clf est un substrat de la mrp2 et de la bsep (boaglio et al., 2010), et la signalisation du clf indique également la fonction de ces transporteurs dans les organoïdes. Enfin, la coloration pas montre un dépôt de Glycogène (Figure 2B) et la tendance à l'augmentation de l'ALb et de l'Urea montre que la fonction anabolique totale du foie n'est pas entravée, même en cas d'urgence de mort cellulaire (figure s1e - f). Ces résultats montrent que les effets des organoïdes sur la fonction hépatique sont relativement stables sur une période de 14 jours.

3.2. Aperçu de l'établissement et de la fonction de la puce intestin - foie

Le quatorzième jour de l'établissement du modèle intestinal, l'intestin et 50 organoïdes hépatiques ont été chargés séparément dans des compartiments distincts pour former un modèle intestin - foie - puce. Les compartiments interconnectés permettent la circulation du liquide dans les canaux et les Chambres, favorisant la co - culture des deux organes. Le système 2oc a été maintenu pendant 7 jours. La figure 3 résume la viabilité cellulaire in vitro et les fonctions intestinales et hépatiques après l'établissement du modèle 2oc. Nous avons surveillé les niveaux de teer (Figure 3A) pour évaluer le maintien de la barrière intestinale, qui s'est maintenue constamment au - dessus de 300 malgré les fluctuations, ce qui indique que l'intégrité de la barrière intestinale a été maintenue de manière constante, même avec la Coculture avec des quantités équivalentes de foie. Au cours de la culture, les niveaux des indicateurs fonctionnels hépatiques ALB (figure 3b) et Urea (figure 3c) ont été mesurés dans les chambres hépatiques. Les niveaux d'ALb ont augmenté au cours des 3 premiers jours, puis ont diminué, tandis que les niveaux d'Urea n'ont pas changé de manière significative. De plus, les taux de LDH, AST et alt ont été évalués pour déterminer la viabilité cellulaire des organoïdes intestinaux et / ou hépatiques (figures 3e et f). Les taux de lactate déshydrogénase (LDH) ont légèrement augmenté dans les deux chambres, tandis que les taux d'aspartate aminotransférase (AST) et d'alanine aminotransférase (ALT) ont augmenté avec le temps de culture. Ces résultats suggèrent des changements dans la fonction et la viabilité cellulaire au sein du système 2oc, suggérant une diminution inattendue de la fonction organique hépatique globale et de la viabilité cellulaire, malgré le maintien de l'intégrité des organoïdes intestinaux. Ensuite, une comparaison des signaux d'immunocoloration a été effectuée pour les organoïdes hépatiques obtenus à partir de puces 2oc et de plaques 96 puits à fond U (figure 3G). Tout d'abord, lors de la culture du substrat en U, on observe principalement que le signal Ki67 est distribué le long des bords de la sphère et uniformément à l'intérieur de celle - ci, bien que son intensité soit plus faible après 7 jours de co - culture de la puce 2oc. Les signaux PGP, mrp2 et bsep le long des bords de la sphère hépatique étaient plus forts lorsqu'ils étaient cultivés sur une plaque de base en U et étaient également détectables à l'intérieur de la sphère. Après 7 jours de co - culture des puces 2oc, on observe une forte signalisation des transporteurs le long des bords, les signaux de PGP et mrp2 étant légèrement plus forts que ceux cultivés sur substrat U. Enfin, du point de vue des deux méthodes de culture, le signal du cytochrome P450 (CYP) 3a4 est dispersé dans la sphère, le signal du modèle 2oc étant légèrement augmenté. Ces résultats décrivent la fonction de base des organoïdes hépatiques et montrent que l'expression de Ki67, PGP et mrp2 dans les sphéroïdes hépatiques dans la puce 2oc diffère quelque peu de celle dans la plaque de base en U.

3.3. Évaluation de la toxicité d'un excès d'acétaminophène dans une puce d'organe diptyque 2oc

Les cellules HepG2 et Caco - 2 ont été exposées à différentes concentrations d'acétaminophène (APAP) pendant 48 heures avant d'être testées sur des puces 2oc. On observe une forte diminution de la survie des cellules Caco - 2 lorsque la concentration dépasse 16 mmoles (figure s2a), alors que l'inhibition des cellules HepG2 dépasse 20% lorsque la concentration d'APAP dépasse 2 mmoles (figure s2a). Ces résultats suggèrent une forte toxicité hépatique possible dans la gamme APAP de 2 à 16 mmol, mais aucun effet toxique significatif n'a été détecté dans les cellules Caco - 2. Dans les organoïdes hépatiques, la survie cellulaire chute à moins de 80% à des concentrations supérieures à 2,5 mmoles (figure s2b), et après 48 heures de traitement avec 4 mmoles d'APAP, la survie des organoïdes hépatiques est mesurée à 70,69 ± 26,97%, ce qui correspond à la tendance apparente à la toxicité observée dans les Cellules HepG2. Sur la base de ces résultats, cette dose a été choisie pour d'autres tests sur les organoïdes intestinaux. Pour atteindre une concentration finale de 4 mm, 10 mm d'APAP ont été administrés depuis la face supérieure pendant 48 heures et la survie et le teer ont été mesurés pour évaluer la viabilité et la fonction barrière des entérocytes. La viabilité cellulaire n'a pas diminué significativement après l'administration du médicament par rapport au groupe témoin (figure s2c). Bien que le teer ait montré une tendance à la baisse (figure s2d), il est resté au - dessus de 300 Ω CM2, répondant aux exigences d'intégrité de la barrière intestinale. Ces résultats montrent que l'APAP présente une Cytotoxicité prononcée sur les cellules hépatiques, mais ne nuit pas à la fonction barrière de l'intestin aux concentrations testées. Dans la puce 2oc, la chambre supérieure contenant les organoïdes intestinaux matures a été ajoutée à la concentration de 10 mmoles d'aspirine (APAP). Après 48 heures, les chambres latérales basales ont montré un taux de survie de 83,94% par sphère, légèrement supérieur à celui de la semelle en U (70,69%). Bien qu'aucune différence significative n'ait été trouvée dans la résistance transépithéliale (teer) (figure 4a). Entre les deux groupes, les taux d'AST (figure 3b) (p < 0,05) et d'ALT (figure 3c) ont montré une tendance à la hausse par rapport au groupe témoin, tandis que les taux d'ALb ont diminué après 48 heures de traitement (figure 3D). AST, ALT et ALb reflètent les dommages au foie, tandis que les niveaux de teer ne reflètent pas la gravité des dommages à la barrière intestinale.

Enfin, nous avons détecté des changements dans le signal de fluorescence après le traitement APAP. La détection du signal Ki67 reflète un changement dans la capacité des cellules à proliférer (figure 4e). Dans le groupe témoin, le signal Ki67 est principalement concentré sur les côtés et un signal de dispersion est observé à l'intérieur de la sphère. La signalisation Ki67 après traitement est devenue non significative latéralement par rapport au groupe témoin, le signal étant principalement concentré à l'intérieur, probablement en raison de l'inhibition accrue de la prolifération cellulaire due à l'exposition plus longue des cellules les plus externes à l'acétaminophène (APAP) que les cellules internes. Ensuite, les niveaux de cellrox ont été détectés et un signal plus fort a été observé dans le Groupe APAP (figure 4f). L'apoptose induite par APAP a été observée dans les sphéroïdes hépatiques et le tmre a été initialement utilisé pour évaluer le potentiel membranaire mitochondrial (figure 4G). Dans le Groupe APAP, l'intensité du signal sur les côtés a diminué, tandis que dans le groupe témoin, le signal a été distribué de manière plus uniforme, ce qui indique que le potentiel de la membrane mitochondriale des cellules latérales à l'intérieur de la sphère a diminué après l'administration d'APAP. Après 48 heures d'incubation sur puce 2oc, l'expression de la cystéine Aspartate protéase - 3 lysée par la protéine apoptotique (figure 4h) et de la p53 (figure 4I) dans le Groupe pancréatite aiguë (APAP) montre un signal plus fort de la cystéine Aspartate protéase - 3 lysée et un signal légèrement amélioré de la p53. Ces résultats montrent que l'inhibition de la prolifération des sphéroïdes hépatiques induite par la pancréatite aiguë, le stress oxydatif et l'apoptose peuvent être détectés après 48 heures d'incubation dans une puce 2oc.

3.4. Absorption et métabolisme du médicament dans la puce d'organe diptyque 2oc

Les figures 5a, b montrent l'évolution de la concentration du médicament au cours du temps dans chaque chambre. Une diminution rapide de la concentration d'acétaminophène a été observée dans la Chambre intestinale (figure 5a), tandis qu'une augmentation correspondante de la concentration du médicament a été détectée dans la Chambre hépatique (figure 5b). À 24 heures, 3,93 ± 0,46 mm et 3,68 ± 0,41 mm d'acétaminophène ont été détectés dans les chambres intestinales et hépatiques, respectivement. Bien que le processus d'absorption soit facile à observer, le processus métabolique n'est pas facile à modéliser, comme en témoigne la diminution non significative de la concentration d'acétaminophène, qui peut être due à une dose excessive du médicament. Même si les concentrations totales de médicaments ont tendance à diminuer (figure 5c), la tendance à la baisse n'est pas seulement due à l'échantillonnage ou au métabolisme des médicaments. Nous avons calculé la quantité totale théorique d'acétaminophène non métabolisé pendant 48 heures en nous référant à la concentration mesurée sur 32 heures. Lorsqu'aucun métabolisme cellulaire ne se produit, la quantité d'acétaminophène doit être de 3,16 ± 0,53 mol; Cependant, la quantité réellement détectée est de 2,95 ± 0,20 mol. Ces résultats suggèrent que l'utilisation de notre puce 2oc peut imiter les processus d'absorption et de métabolisme des médicaments, même en cas de surdosage. Suivant. Nous avons détecté le métabolite toxique napqi, qui n'a pas été détecté dans le surnageant. Afin de décrire avec précision le processus d'absorption du médicament dans la puce 2oc, nous avons calculé les paramètres cinétiques d'absorption du médicament pour l'acétaminophène (APAP) à l'aide du modèle NCA. Les Tmax (temps de crête), cmax (concentration de crête) et AUC (aire sous la courbe) calculées étaient respectivement de 24 ± 11,31 H, 3,98 ± 0,59 mm et 157,73 ± 14,88 H MM. Cependant, il est difficile d'ajuster les paramètres cinétiques d'élimination du médicament en raison de la très faible diminution de la concentration d'APAP.

4. Discussion

Cette étude utilise une plate - forme de puce Multi - organes intestinal - hépatique in vitro pour évaluer l'absorption du médicament et prédire la toxicocinétique et ses effets toxiques. Nous avons construit un système de puce intestin - foie en couplant deux organes indépendants sur une plate - forme de puce Multi - organes 2oc pour recréer l'absorption continue de médicaments par voie orale d'acétaminophène (APAP) et les lésions hépatiques aiguës qui en découlent. Dans le système 2oc, les taux d'absorption et les effets toxiques de l'APAP sont compatibles avec les processus de traitement in vivo connus. Ces résultats suggèrent que le processus d'absorption peut être simulé dans notre modèle 2oc et que des effets toxiques peuvent être détectés en présence d'organes intestinaux en amont, ce qui est cohérent avec les rapports précédents. Nos résultats soutiennent l'utilisation future de modèles de puces Multi - organes couplés à plusieurs organes comme modèles auxiliaires pour la prédiction de la toxicité des médicaments. La construction intestinale a été réalisée à l'aide de cellules Caco - 2 et HT29 - MTX - E12, sur la base du rapport cellules épithéliales intestinales / cellules caliciformes dans l'intestin grêle humain (Chen et al., 2017; Tsamandouras et al., 2017). Des sphéroïdes hépatiques ont été créés en fonction de la proportion de composants cellulaires dans un foie sain (Weiler - Normann et rehermann, 2004). Sur la base d'études antérieures, nous avons examiné la structure et la fonction hépatique dans une co - culture de deux semaines. La signalisation induite par HUVEC - T1 des marqueurs CD31 (Newman, 1997), cd68 (Gao et al., 2018) et alpha - SMA (chiabotto et al., 2021) de THP - 1 et hhsc indique la distribution cellulaire après 10 jours de co - culture. L’accumulation d’insuffisance hépatique chronique (clf) (Hopwood et al., 2006), les transporteurs mrp2, bsep et PGP (rendic, 2021) et l’augmentation des taux d’albumine (ALb) et d’urée (Urea) (baudy et al., 2020) illustrent respectivement l’augmentation du transport biliaire, de la fonction d’évacuation des médicaments et de la fonction anabolique. L'insuffisance hépatique chronique s'accumule dans la Structure tubulaire de la sphère 3D (ramaiahgari et al., 2014), un signal indiquant la formation d'une structure tubulaire préliminaire après 7 jours de culture. Nous avons construit une puce intestin - foie basée sur un dispositif microfluidique basé sur nos organoïdes intestinaux et hépatiques (marin et al., 2019; Maschmeyer et al., 2015). D’autres modèles entéro - hépatiques suggèrent que la surface des organes et la capacité métabolique peuvent influencer l’absorption et le métabolisme des médicaments oraux (Lee et al., 2017). La toxicité hépatique a été évaluée à l’aide de l’aspartate aminotransférase (AST) et de l’alanine aminotransférase (ALT) (Meunier et Larrey, 2019). Après 3 jours de co - culture, sa tendance à la hausse indique la présence de lésions hépatocellulaires potentielles, tandis que la tendance à la baisse de l’albumine (ALb) peut être due à un approvisionnement insuffisant en nutriments, à l’administration de médicaments, à la malnutrition, à une réduction de l’apport en protéines et à des lésions hépatiques (belinskaia et al., 2020; Meunier et Larrey, 2019). Dans cette étude, la signalisation du CYP3A4 a été légèrement améliorée, ce qui est cohérent avec les résultats d’études antérieures suggérant que l’activité du CYP3A4 est augmentée après co - culture intestinale - hépatique (Chen et al., 2018b; Shinohara et al., 2021).

Comme des études antérieures ont porté principalement sur l’amélioration de l’activité métabolique des organoïdes hépatiques après une Coculture intestin - foie (Shinohara et al., 2021), nous nous sommes concentrés sur les transporteurs mrp2, PGP et bsep, qui médient l’élimination des substances exogènes des cellules hépatiques (jetter et kullak - ublick, 2020). Nos résultats montrent clairement que le modèle 2oc est capable de simuler l'absorption des dangers toxiques après administration orale et que le surnageant est facile à conserver pour la surveillance des biomarqueurs humains.

Cette concentration a été choisie pour les raisons suivantes: 1) l'intégrité de la barrière intestinale n'est pas compromise à la concentration testée; 2) L'effet toxique du médicament sur le foie est plus élevé que sur l'intestin. Bien que l’absorption de l’acétaminophène (APAP) soit largement influencée par la vidange gastrique (toes et al., 2005), elle est absorbée principalement par diffusion passive dans l’intestin grêle proximal (m’esza’ros et al., 2022). In vitro, il a été démontré que des concentrations élevées d’apap réduisent la viabilité des cellules hépatiques (Bell et al., 2020). À faible dose, APAP a montré un effet toxique limité; Cependant, en cas de surdosage ou d’abus de substances, l’apap peut causer des lésions hépatocellulaires aiguës et graves (bunchorntavakul et Reddy, 2018). La relation entre les concentrations d’exposition et les effets toxiques au fil du temps peut expliquer le risque de toxicité dépendante du temps et les mécanismes moléculaires des produits chimiques (tennekes et Sánchez - Bayo, 2013). La concentration d'APAP est essentielle pour refléter l'exposition au médicament; Nous avons donc détecté le transbordement de l'APAP (bessems et Vermeulen, 2001; Krenkel et al., 2014; Makin et Williams, 1996).

L'acétaminophène (APAP) a une bonne biodisponibilité orale (88%), car il est bien absorbé et atteint des concentrations plasmatiques maximales dans les 90 minutes suivant l'ingestion (hodgman et Garrard, 2012). Dans notre étude, les valeurs prédites de Tmax dans notre modèle 2oc (24 ± 11,31 h) étaient supérieures aux données cliniques (0,33 - 4 h) et aux résultats d’autres puces 2oc (6 h) (marin et al., 2019). L'APAP est absorbé rapidement aux doses thérapeutiques et ralentit à mesure que la dose augmente (Rosenberg et coll., 1981). Aux doses thérapeutiques, la demi - vie plasmatique de l'APAP est comprise entre 1,5 et 2,5 heures; Cependant, nous avons détecté un équilibre des concentrations du médicament dans les deux chambres après 24 heures, ce qui est conforme aux résultats des études précédentes. Rawlins et al. (1977) ont mesuré les concentrations plasmatiques après administration orale d'APAP (500, 1 000 et 2 000 mg) chez des volontaires et ont montré un retard de Tmax à 2 000 mg. Certains rapports de cas ont montré que l'administration excessive de préparations d'APAP entraînait un retard des concentrations plasmatiques maximales et une absorption prolongée de l'APAP (Chiew et coll., 2010; Graudins et al., 2010; Roberts et Buckley, 2008). Mazaleuskaya et al. (2015) concluent que la demi - vie est prolongée à 4 - 8 heures en raison de l’altération du métabolisme après un surdosage d’apap. Une dose hépatotoxique sans entérotoxicité a été choisie, administrée à des concentrations (acétaminophène, 4 mmol, 604,64 mg / l) environ quatre à six fois supérieures aux concentrations plasmatiques toxiques (100 - 150 mg / l) et deux à trois fois supérieures aux concentrations plasmatiques mortelles dans le coma (200 - 300 mg / l) (Schulz et al., 2020). Étant donné que les concentrations toxiques d’acétaminophène in vitro (Bell et al., 2020) dépassent de loin les concentrations plasmatiques thérapeutiques chez l’homme (5 à 25 mg / l) (Schulz et al., 2020), aucun processus d’élimination du médicament n’a été observé dans notre étude en 48 heures. Les preuves auxiliaires de pharmacocinétique (PK) suggèrent que d'autres modifications du modèle de puce sont nécessaires, en particulier pour approfondir les méthodes de conversion des données in vitro et cliniques en clinique afin d'améliorer la pertinence des résultats in vitro pour la clinique.

Enfin, nous avons testé les effets toxiques de notre appareil sur les cellules sphéroïdes du foie. La survie des cellules sphéroïdes dans les puces 2oc a été légèrement améliorée par rapport aux plaques 96 puits, reflétant spécifiquement les changements de toxicité du médicament en fonction de la concentration du médicament et de l'exposition au temps. L'ingestion excessive d'acétaminophène (APAP) augmente considérablement les taux sériques d'aspartate aminotransférase (AST) et d'alanine aminotransférase (ALT) (Acheampong et Thomas, 2016; Stockman， 2008); Cependant, les niveaux d'Ast et d'alt ont légèrement augmenté après 48 heures d'exposition dans le modèle 2oc. Dans le même temps, la régulation à la baisse de l'ALb indique que la fonction métabolique du foie est inhibée et que des lésions hépatiques graves se sont produites. Cette baisse est conforme à un rapport précédent (Wu et al., 2022). Après l'administration du médicament, le signal Ki67 (nécessaire à la Division cellulaire) des cellules les plus externes a diminué, indiquant que la prolifération des cellules les plus externes était inhibée. Initialement, nous avons détecté des sphères hépatiques obstruées après le traitement de la pancréatite aiguë.

Aux doses thérapeutiques, l'acétaminophène est converti en métabolites non toxiques, principalement par glucuronidation et sulfatation. L'acétaminophène est oxydé par l'enzyme CYP2E1 et activé en tant que produit toxique inhibiteur de la n - acétylaspartate aminotransférase (napqi). Napqi épuise le glutathion (GSH) et le convertit en acétaminophène - cystéine. Lorsque le GSH est inférieur à 30% de la normale, le napqi n'est plus réduit, provoquant une réaction toxique. Bien que le napqi soit détectable dans le sérum animal et les organes (russomanno et al., 2023; Zhang et al., 2018), mais à l’exception des cellules hépatiques primaires (pingili et al., 2019), il reste difficile de détecter ce produit intermédiaire instable dans les lignées cellulaires (Zhang et al., 2020). Comme mentionné précédemment (Zhang et al., 2020), seule une petite quantité d’acétaminophène est convertie en napqi, dont la demi - vie est extrêmement courte (coles et al., 1988; Madsen et al., 2007). Il peut être rapidement et facilement détoxifié en 130 millisecondes en se liant au GSH (coles et al., 1988; Madsen et coll., 2007), ou par réduction à l'acétaminophène par NADPH, dihydronicotinamide adénine dinucléotide et réductase (Zhang et coll., 2020), d'où la difficulté de détecter le napqi dans son modèle in vitro (Zhang et coll., 2020). La liaison à la protéine APAP se produit après l'épuisement du glutathion (GSH), un événement précoce dans le mécanisme hépatotoxique (jaeschke et al., 2014; McGill et coll., 2013). Comme modèle in vitro alternatif, la déplétion GSH (Leclerc et al., 2015), la capacité oxydante (geib et al., 2021; Leclerc et al., 2015), liaison aux protéines covalentes (geib et al., 2019, 2021; Pierce et coll., 2002) et les données sur la toxicité in vitro obtenues à l'aide de modèles de biologie des systèmes (Leclerc et coll., 2015) pourraient être des méthodes alternatives pour suivre ou suggérer la formation et l'accumulation de napqi. Le napqi se lie aux protéines mitochondriales pour induire l'Acylation des protéines, ce qui entraîne une nécrose ou un stress oxydatif des cellules hépatiques, ainsi qu'un dysfonctionnement mitochondrial, ce qui entraîne éventuellement l'apoptose et des lésions hépatiques (bessems et Vermeulen, 2001; Krenkel et al., 2014; Makin et Williams, 1996; Saito et al., 2010). Au cours de la pathogenèse hépatotoxique induite par la pancréatite aiguë (APAP), les cellules du foie présentent un dysfonctionnement mitochondrial et un stress oxydatif (Shan et al., 2018; Ye et al., 2018). Après le traitement, la diminution de la signalisation tmre dans le modèle hépatique indique une diminution du potentiel de la membrane mitochondriale dans les cellules du foie (en particulier les cellules latérales) et une altération de la fonction mitochondriale. Le potentiel de membrane mitochondriale indique un changement dans l'activité mitochondriale et une perturbation de l'homéostasie mitochondriale (vianello et al., 2023). Dans les premiers stades de l'insuffisance hépatique aiguë, le potentiel de la membrane mitochondriale diminue, ce qui entraîne des changements morphologiques mitochondriaux et affecte la fonction mitochondriale, qui est le signal initial de dommages aux cellules du foie (Li et al., 2011; Umbaugh et al., 2021). Étant donné que le stress oxydatif causé par l’insuffisance hépatique aiguë peut altérer le repliement des protéines et déclencher un stress du Réticulum endoplasmique (Ferret, 2001; Ye et al., 2018), nous avons utilisé cellrox pour localiser les signaux d’oxygène actif et avons observé la distribution d’un grand nombre de signaux d’oxygène actif dans le Groupe de l’insuffisance hépatique aiguë. Ces résultats suggèrent que des changements dans le potentiel de la membrane mitochondriale et le stress oxydatif cellulaire peuvent être détectés dans un modèle hépatique après avoir simulé un excès d'insuffisance hépatique aiguë à l'aide d'une puce 2oc.

L'apoptose hépatique se produit aux premiers stades de l'insuffisance hépatique aiguë (possamai et al., 2013). L’insuffisance hépatique aiguë (induite par l’apap) entraîne une déplétion du glutathion (GSH) et l’apap déclenche des voies et des processus toxiques mitochondriaux qui transforment les précurseurs 3 / 7 de la cystéine Aspartate protéase en une cystéine Aspartate protéase active lysée (Baek et al., 2016). La cystéine Aspartate protéase - 3 est un acteur clé de l'apoptose, dont les formes enzymatiques précurseurs sont lysées avant d'être converties en formes actives (Fernandes - alnemri et al., 1994). Le gène suppresseur de tumeur p53 régule l'apoptose par activation transcriptionnelle (Arakawa, 2005). La toxicité hépatique induite par l'APAP peut entraîner une légère régulation à la hausse de la p53 (Chen et coll., 2018a). Après l'administration d'APAP, la signalisation de la protéine cystéine Aspartate protéase - 3 lysée a été significativement augmentée et la signalisation p53 légèrement augmentée, ce qui suggère que APAP induit une signalisation apoptotique.

Cependant, il est indéniable que les modèles animaux ont contribué de manière significative à la compréhension et aux progrès de la médecine moderne, en particulier au cours des dernières décennies, ce qui pourrait ne pas être remplacé par des modèles in vitro alternatifs pour l'évaluation de la sécurité des médicaments et des produits chimiques. Bien que ces nouveaux modèles aient joué et continuent de jouer un rôle important dans la recherche biomédicale et réglementaire, permettant l’étude des effets en série d’une substance et offrant une sensibilité élevée, non perturbée par d’autres phénomènes biologiques (Kaplan et al., 2024). D'autre part, il convient de souligner que le modèle 2oc ne peut certainement pas encore remplacer les modèles biologiques existants, mais plutôt servir d'outil de recherche pour fournir des informations spécifiques à l'avance afin de réduire le nombre d'animaux nécessaires au dépistage des médicaments. Nos résultats suggèrent que le modèle 2oc peut mesurer l'absorption de médicaments et détecter les changements de signal associés à de multiples toxicités à l'aide de sondes fluorescentes, démontrant la possibilité d'une puce Multi - organes comme preuve auxiliaire pour détecter simultanément l'efficacité / la toxicité et le potentiel pharmacocinétique du médicament.

5. Conclusion

Nous avons construit un intestin - foiePuce d'organe diptyqueSystématique, et ses effets toxiques ont été évalués en simulant le processus de lésions hépatiques aiguës après un excès d'acétaminophène (APAP). Des organoïdes intestinaux ont été établis par co - culture de cellules Caco - 2 et HT29 - MTX - E12, et des organoïdes sphéroïdes hépatiques ont été établis avec HepG2, HUVEC - T1, cellules THP - 1 induites par PMA et hhsc. L'expression de PGP, mrp2 et CYP3A4 dans les organoïdes hépatiques a été légèrement améliorée dans les Chipsets Multi - organes. Après obtention des courbes Concentration - temps de l'APAP dans les deux chambres, les paramètres toxicocinétiques Tmax, cmax et AUC ont été ajustés par la méthode NCA. Le traitement APAP a augmenté les niveaux des biomarqueurs hépatotoxiques AST et ALT, réduit la sécrétion d'albumine (ALb), inhibé la prolifération cellulaire, amélioré la signalisation de l'oxygène réactif (ROS), réduit le potentiel de la membrane mitochondriale, activé la caspase - 3 et amélioré la signalisation p53. Cette étude fournit des preuves supplémentaires pour l'application des puces d'organes dans les études de toxicité des médicaments, tout en détectant le contenu du médicament et la réponse toxique, offrant le potentiel de prédire les propriétés pharmacocinétiques et toxicologiques des composés candidats.