Pour résoudre ce problème, l'équipe de développement a conçu une plate - forme d'imagerie par fluorescence multimodale intégrant un système de navigation par fluorescence à large champ (Wf - nav) avec une microimagerie miniaturisée à deux photons et une microimagerie miniaturisée à trois photons. Pour tirer pleinement parti des avantages de l'excitation à un seul photon, le système wf - nav est équipé d'un grand champ de vision et d'une résolution unicellulaire permettant d'identifier rapidement les zones d'intérêt désignées. Une fois positionné dans la zone cible, le système peut passer de manière transparente à l'imagerie biphotonique ou triphotonique, permettant un rapport signal / bruit élevé ou une imagerie neuronale profonde. Une sonde m2pm ou m3pm a ensuite été fixée à la tête de la souris, libérant la souris pour une imagerie libre.

Figure 1. Conception du système d'imagerie par fluorescence multimodale

Le système wf - nav se compose d'un microscope grand champ multicolore et d'un adaptateur multifonction. Le système utilise trois LED comme source d'excitation (405 nm, 473 nm, 561 nm) et collimate le faisceau LED avec une lentille de concentration asphérique dotée d'une ouverture numérique élevée, chaque chemin optique d'excitation étant équipé d'un jeu de filtres respectif. Pour permettre la navigation dans un grand champ de vision et fournir beaucoup d'espace pour la commutation transparente des groupes de miroirs multiphotons, l'équipe de développement a conçu un objectif sec avec une longue distance de travail et un faible grossissement. Cet objectif (3,3x) est doté d'un design anti - téléobjectif: le Groupe avant fournit une puissance optique négative pour les deux lentilles collées bi - synthétiques, tandis que le Groupe arrière est constitué d'une lentille sphérique monolithique. Cette structure repousse le plan principal pour corriger l'aberration chromatique, ce qui permet d'atteindre une distance de travail de très longue distance focale effective tout en conservant l'ouverture numérique, ce qui permet d'atteindre un indicateur révolutionnaire de distance de travail de 90 mm et d'atteindre un champ de vision maximal de Φ 5,64 MM.

Figure 2. Conception de microscope à fluorescence à champ large

Pour permettre une commutation transparente entre le mode champ large et le mode d'imagerie multiphotonique, l'équipe a conçu un adaptateur multifonction. Cet adaptateur connecte un objectif grand champ et effectue le réglage de la distance focale sur une plate - forme motorisée en axe Z. Grâce à la conception normalisée de la sonde m2 / 3pm, la sonde peut être solidement montée sur le même support et garantit une imagerie confocale lorsque les multiphotons sont commutés en mode grand champ.

Figure 3. Adaptateur multifonction avec fonction affleurante

Cet objectif avec une distance de travail de 90mm offre beaucoup d'espace pour manipuler des pièces de tête, des fibres optiques ou pour monter un module de lentille de zoom électrique amovible. Le support de tête est monté sur des glissières à billes droites légères avec une faible résistance au glissement (environ 0,1 N) et une distance de dilatation de 12 mm, ce qui permet d'éviter efficacement les risques de collision de l'objectif avec l'échantillon. En remplaçant le support de tête, le système peut être compatible avec différentes pièces de tête telles que mini2p et m3pm. De plus, grâce à la taille d'un microscope à deux photons miniaturisé par rapport à une conception rétractable, le système offre un angle d'observation plus grand dans la plupart des directions par rapport à un objectif de paillasse classique, ce qui permet une plus grande plage d'observation de l'échantillon. Cette conception améliore considérablement l'efficacité du positionnement grossier de l'échantillon.

Figure 4. Comparaison des différents objectifs avec l'angle d'observation d'un microscope à deux photons miniaturisé

Ensuite, les développeurs ont évalué les performances optiques de la microscopie à fluorescence à large champ par rapport aux applications pratiques. L'imagerie de coupes cérébrales de souris thy1 - yfph a permis d'identifier clairement les neurones et les axones. L'imagerie des ions Calcium vivants à 470 nm et l'imagerie morphologique à 561 nm ont permis de capturer 3 804 neurones marqués gcamp6f ainsi que 4 650 astrocytes murins exprimant mcherry. Ces résultats démontrent que ce microscope à large champ possède des capacités d'imagerie multicolore, à résolution unicellulaire et à haut débit, et offre d'excellentes performances pour la navigation dans les zones d'intérêt.

Vidéo 5. Microscope miniaturisé à large champ imagerie à haut débit

Pour rendre l'imagerie m2pm plus fluide chez les souris en mouvement libre, les développeurs ont mis en place un ensemble de processus d'imagerie normalisés pour améliorer l'efficacité de l'imagerie m2pm chez les animaux en mouvement libre. Les animaux sont d'abord injectés avec le virus et les procédures chirurgicales telles que l'implantation craniofenêtrale ou l'implantation grin - Lens, suivie d'une attente de 2 à 4 semaines pour assurer la pleine expression du virus et la récupération de la lésion chirurgicale. Pour prendre l'exemple d'une certaine expérience, nous avons étiqueté gcamp6s et mcherry dans les neurones du cortex moteur primaire (M1), puis fixé les souris sur un tapis roulant sous l'appareil wf - nav. La zone d'intérêt cible est ensuite localisée et alignée au Centre du champ visuel par microscopie à champ large. Le passage ultérieur en mode m2pm via l'adaptateur, l'imagerie bicolore biphotonique aux longueurs d'onde de 920 nm et 1030 nm et enfin l'ajustement fin de l'axe XY et du plan focal permettent de confirmer la zone cible finale en quelques minutes. La plupart du temps, le plan focal cible sera relevé d'environ 25 µm pour compenser le décalage de la mise au point causé par la contraction du ciment, puis Baseplate sera fixé sur la tête de l'animal et, après environ 10 minutes de solidification, les souris seront prêtes pour l'imagerie en mouvement libre.

Figure 6. Processus normalisé d'imagerie microscopique à deux photons à activité libre

Les développeurs ont validé le système en imageant la signalisation calcique et la structure des neurones dans une expérience sociale sur souris, où l’ensemble des opérations d’installation ont pris environ 20 minutes et ont eu un taux de réussite allant jusqu’à 100% (n = 15), facilement maîtrisé même par des chercheurs inexpérimentés, améliorant ainsi considérablement l’efficacité de l’expérience. De plus, plusieurs jours d'imagerie répétée de neurones et d'astrocytes de la couche 2 de la région M1 ont montré que l'enregistrement du champ visuel était stable sans réinstallation de Baseplate.

Figure 7. Imagerie du même champ visuel sur plusieurs jours

Grâce à une conception mécanique standardisée, la tête d'imagerie m3pm peut être facilement montée sur un support. Appliquez un adaptateur multifonction qui permet une commutation transparente du mode champ large au mode d'imagerie à trois photons. Les signaux profonds sont souvent difficiles à détecter en raison des limites de la profondeur d'imagerie par microscopie à photon unique à large champ; Bien que les vaisseaux superficiels puissent servir de référence, les zones d'injection virale qui conservent la couche superficielle fournissent des marqueurs fluorescents plus directs qui aident à aligner les sites plus profonds sur l'axe vertical. Les développeurs ont réussi à enregistrer l'activité neuronale de la région postsubiculum de la surface corticale à des profondeurs allant jusqu'à 1020 µm chez des souris dont la tête était fixée et qui exprimaient gcamp6f, et ont mené des expériences d'exploration comportementale de l'absentéisme chez la souris qui ont enregistré une activité de signalisation calcique prolongée à une profondeur de 670 µm.

Figure 8. Fixation miniaturisée à trois photons et imagerie comportementale libre

Le travail a été effectué par le professeur Wu runlong de l'Université des sciences et technologies de l'information de Beijing (auteur correspondant), Wang Aimin de l'Université de Beijing, le Professeur Cheng Ping et d'autres.

[Références]

Wu R, Sun Y, Hao Z, et al. Système de navigation par fluorescence à large champ pour une imagerie multiphotonique en miniature efficace chez les animaux se comportant librement. Neurophotonique. 2025; 12(2):025018. doi:10.1117/1.NPh.12.2.025018