I. optimisation des objectifs fondamentaux
Synthétiseur polypeptidique multicanalL'avantage principal réside dans la « synthèse parallèle, production de masse», l'optimisation de l'efficacité doit être développée autour de « l'amélioration du succès de la synthèse à canal unique, la réduction de la période de synchronisation multicanaux, la réduction des pertes de réactions secondaires», en garantissant la pureté du polypeptide (généralement ≥ 95%), la production de synthèse d'un plus grand nombre de Polypeptides de haute qualité par unité de temps, tout en contrôlant les coûts de consommation de réactifs.
Optimisation des paramètres de synthèse: régulation précise pour améliorer l'efficacité de la réaction
1. Optimisation des paramètres d'activation des acides aminés
Ratio réactif d'activation à la concentration: ajustement du système d'activation en fonction du type d'acide aminé (hydrophobe / hydrophile, tendance à l'alpha - hélice / bêta - pliage), par exemple lors de la synthèse d'acides aminés peu solubles (par exemple valine, leucine), en utilisant le système d'activation hbtu / hobt / DIEA, le ratio molaire réactif d'activation à l'acide aminé est porté à 1,2: 1,0, la concentration est contrôlée à 0,2 - 0,4 mol / L, assurant une activation adéquate; Les acides aminés conventionnels peuvent adopter le système DIC / hobt, le rapport molaire 1,0: 1,0 peut répondre aux besoins et réduire le gaspillage de réactifs.
Contrôle du temps d'activation: le temps d'activation conventionnel des acides aminés à température ambiante est de 3 à 5 minutes, les acides aminés contenant des chaînes latérales β - ramifiées ou aromatiques (par exemple isoleucine, Phénylalanine) doivent être prolongés à 5 à 8 minutes pour éviter que l'activation ne provoque une diminution complète de l'efficacité de condensation; L'injection doit être terminée dans les 30 minutes suivant l'activation, empêchant la dégradation de l'intermédiaire d'activation.
2. Optimisation des paramètres de la réaction de condensation
Température et temps de réaction: la synthèse polypeptidique conventionnelle utilise une réaction à température ambiante (25 ± 2 ° c) avec un temps de condensation en une seule étape de 20 à 30 minutes; Pour les Polypeptides présentant une obstruction stérique (tels que les séquences contenant plusieurs groupes protecteurs proline, tert - butyle), la température peut être augmentée à 37 ° C et le temps de condensation prolongé à 40 - 60 minutes, ou le mode de montée en température segmentée (d'abord à température ambiante pendant 10 minutes, puis à 37 ° C pendant 30 minutes) peut être utilisé pour augmenter la conversion de la réaction.
Choix du solvant et dosage: DMF comme solvant de base, la synthèse de Polypeptides hydrophiles peut ajouter 10% - 20% de DMSO pour augmenter la solubilité; Lors de la synthèse synchrone Multi - canaux, la quantité de solvant utilisée par chaque canal doit être contrôlée avec précision par 5 à 8 fois le volume de résine, pour assurer un gonflement suffisant de la résine, un contact homogène des réactifs avec la résine et éviter une réaction locale incomplète due à un solvant insuffisant.
3. Optimisation des paramètres de déprotection
Concentration en réactif de déprotection et temps: une solution de Pipéridine / DMF à 20% est utilisée comme réactif de déprotection, le temps de déprotection de la séquence conventionnelle est de 10 à 15 minutes; Pour les acides aminés contenant des groupes difficiles à déprotecter tels que FMOC - Arg (PBF), FMOC - ASN (TRT), la concentration en Pipéridine peut être augmentée à 25% ou déprotégée en deux fois (5 min pour la première fois, 10 min pour la déprotection supplémentaire avec ajout d'un nouveau réactif après le rejet), en assurant un taux de déprotection ≥ 99% et en évitant que les groupes protecteurs résiduels n'affectent la condensation ultérieure.
Optimisation du processus de lavage: 3 à 5 lavages avec du DMF après déprotection, chaque volume de lavage est 6 fois le volume de résine, le temps de lavage est de 30 secondes par lavage, tout en activant la fonction d'agitation synchrone multicanaux, améliorant l'efficacité du lavage et réduisant la racémisation des acides aminés due aux résidus de pipéridine.
Iii. Optimisation Collaborative multicanal: évitez les goulots d'étranglement de synchronisation
1. Conception d'équilibrage de charge de canal
En fonction de la longueur de la séquence polypeptidique et du canal de répartition de la difficulté, les séquences courtes (≤ 10 acides aminés) sont réparties de manière croisée avec les séquences longues (≥ 20 acides aminés), les séquences faciles à synthétiser et les séquences difficiles à synthétiser dans différents canaux, en évitant que les canaux individuels ralentissent le cycle de synthèse global en raison d'un temps de réaction trop long. Par exemple: synthèse à 4 canaux, 2 canaux synthétisent 15 Peptides (difficulté conventionnelle), 1 canal synthétise 25 Peptides (difficulté élevée) et 1 canal synthétise 8 Peptides (facile à synthétiser), la synchronisation approximative Multi - canaux est obtenue par une allocation rationnelle.
2. Optimisation de l'approvisionnement et de la distribution des réactifs
Préparation à l'avance du réactif de prémélange: lors de la synthèse en vrac du même type de polypeptide, prémélanger à l'avance le réactif d'activation avec la solution d'acides aminés par le nombre de canaux, en utilisant des flacons de réactifs spéciaux après le remplissage correspondant à chaque canal, pour éviter le temps perdu dans la formulation d'un canal unique, tout en veillant à ce que la concentration du réactif dans chaque canal soit cohérente.
Inspection de la ligne et de la vanne: vérifiez si la ligne de distribution de réactif multicanaux est passante avant la synthèse, si la réponse de l'interrupteur de l'électrovanne est sensible, assurez - vous que l'erreur de quantité de réactif dans chaque canal est ≤ ± 2%; Pour les réactifs faciles à cristalliser (par exemple, hbtu), il est nécessaire d'envelopper la gaine thermique (température 25 - 30 ℃) à l'extérieur du flacon de réactif pour éviter que la cristallisation ne bloque la ligne conduisant à un apport inégal.
3. Lorsque le gradient se réchauffe et contrôle synchrone
Pour le cas de l'hystérésis de réaction de canal partiel dans la synthèse multicanaux, la stratégie de gradient de réchauffement peut être adoptée: pour les canaux de réaction plus lente individuellement augmenter la température (pas plus de 40 ℃), tout en définissant le mode "Injection prioritaire de canal d'hystérésis" par le logiciel d'exploitation, économisez 1 - 2 minutes pour le canal d'hystérésis dans la déprotection préalable, étape de lavage, assurez - vous que la réaction de condensation finale multicanaux synchrone est terminée, réduire le temps d'attente
Optimisation de la gestion de l'équipement et des réactifs: les bases de l'efficacité du donjon
1. Prétraitement et entretien de l'équipement
Activez la fonction de préchauffage de l'équipement avant la synthèse, Stabilisez la température de la cellule de réaction à la valeur de consigne (± 0,5 ° c), tout en calibrant la palette d'agitation multicanaux, assurez - vous que la vitesse d'agitation de chaque canal est cohérente (erreur ≤ 5 tr / min), évitez Les différences locales d'efficacité de réaction dues à une agitation inégale.
Nettoyage régulier (par 50 lots de synthèse) de la ligne de distribution du réactif avec le réacteur, 3 rinçages alternés avec du DMF, du méthanol, élimination des acides aminés résiduels avec la précipitation du réactif, prévention du colmatage ou de la contamination croisée de la ligne, garantie de l'efficacité de livraison du réactif.
2. Gestion de la qualité et du stockage des réactifs
Choisissez des réactifs de haute pureté (pureté des acides aminés ≥ 99%, pureté des réactifs d'activation ≥ 99%), évitez les impuretés entraînant une augmentation des réactions secondaires; Le stockage des réactifs doit être classé selon les exigences: après le scellement des acides aminés solides - 20 ℃ Cryoconservation, réactifs liquides (par exemple, Pipéridine, DMF) sont conservés à l'abri de la lumière à la température ambiante et sont utilisés dans les 3 mois après ouverture.
Vérifiez l'état du réactif avant utilisation: la teneur en eau du DMF doit être ≤ 0,05% (peut être détectée par la méthode de kalferhue), le réactif d'activation n'a pas de grumeaux, le phénomène de décoloration, si le réactif n'est pas conforme doit être remplacé à temps, pour éviter la baisse ou l'échec de l'efficacité de synthèse en raison de problèmes de réactifs.
V. Stratégies spéciales d'optimisation de l'efficacité des séquences de synthèse difficile
Polypeptides hydrophobes: la solubilité du polypeptide est augmentée par un "système solvant en phase inverse" (DMF / dichlorométhane = 7: 3) avec ajout de 0,1% de trifluoroéthanol comme co - solvant; La méthode de « double activation » est utilisée lors de la condensation (activation de l'hbtu d'abord suivie d'une petite quantité de pybop pour renforcer l'activité de la réaction) et le temps de condensation en une seule étape est porté à 60 minutes.
Contenant plusieurs Séquences répétées d'acides aminés: par example Poly - Gly, Poly - Ala, ajout d'une étape de "prélavage" (2 lavages de la résine au DCM) avant de répéter la charge d'acides aminés, réduction des fragments de base protectrice restant à la surface de la résine; Réduisez également la température de condensation à 20 ° C et évitez la racémisation des acides aminés causée par des températures élevées.
Synthèse des peptides cycliques: dans l'étape de cyclosynthèse, on utilise un "système réactionnel à haute concentration" (la concentration de résine est augmentée à 0,1 g / ML), on ajoute une quantité catalytique de Hoat (0,1 EQ) et on ajoute le réactif de cyclosynthèse en utilisant le mode "goutte à goutte lente", Le temps de goutte à goutte est contrôlé à 10 - 15 minutes, l'efficacité de la cyclosynthèse est améliorée et le Peptide linéaire reste réduit.
Vi. Optimisation de la vérification et de l'ajustement des effets
L'efficacité doit être vérifiée par trois indicateurs après chaque Optimisation: ① efficacité de synthèse (nombre de lots de Polypeptides éligibles réalisés par unité de temps); ② pureté polypeptidique (détection par HPLC, pureté cible ≥ 95%); ③ monoconsommation de réactif (quantité de réactif consommée par 1 mmol de polypeptide synthétisé). Si un indicateur n'est pas atteint, les paramètres doivent être ajustés de manière ciblée: si la pureté est insuffisante, le temps de déprotection ou de condensation est optimisé, l'efficacité n'est pas améliorée, la répartition de la charge du canal ou l'état de fonctionnement de l'équipement sont vérifiés pour s'assurer que le schéma d'optimisation est efficace.