Fermenteur de laboratoire en acier inoxydableEn tant qu'équipement de base pour la culture microbienne, la synthèse des produits métaboliques et la recherche sur les réactions biologiques, il est largement utilisé dans la microbiologie, la bio - ingénierie, la science alimentaire et d'autres domaines, grâce aux avantages de la résistance à la corrosion, du nettoyage facile et de la précision du contrôle de la température. Sa spécification opérationnelle détermine directement la stabilité du système de fermentation et la répétabilité de l'expérience, tandis que le processus de stérilisation est une condition préalable essentielle pour éviter la contamination par des bactéries diverses et garantir le succès de l'expérience. Cet article détaillera le processus d'exploitation standard des fermenteurs en acier inoxydable de laboratoire avec les méthodes de stérilisation de base pour fournir aux expérimentateurs un guide pratique de mise au sol.
I. processus opérationnel de fermenteur en acier inoxydable de laboratoire
Le fonctionnement du fermenteur en acier inoxydable de laboratoire doit suivre la logique en boucle fermée de « préparation - mise en service - fermentation - fermeture», le noyau est la température de contrôle précise, pH、 Oxygène dissous, agitation et autres paramètres clés pour répondre aux besoins de croissance et de métabolisme microbiens.
(i) préparation avant l'opération: les bases de l'expérimentation du donjon
Inspection de l'équipement: vérifier l'état des composants de base du fermenteur un par un - le réservoir et les joints ne sont pas cassés, ne fuient pas; Rotation de la palette d'agitation flexible sans Katun; Capteur de température, électrode de pH, électrode d'oxygène et autres sondes nettoyées sans rayures; Tuyau d'admission, tuyau de remplissage, tuyau d'échappement et d'autres lignes sans obstruction; Soupapes de sécurité, manomètres et autres composants de sécurité pendant la période de validité du contrôle. Vérifiez également que l'équipement d'accompagnement (par exemple, compresseur d'air, refroidisseur d'eau, pompe péristaltique, pot de stérilisation) fonctionne correctement.
Préparation du matériau: le milieu est formulé avec précision selon la formule de fermentation, en veillant à ce que les composants (source de carbone, source d'azote, sels inorganiques, oligo - éléments, etc.) soient pesés avec précision et suffisamment dissous pour éviter l'agglomération. Les composants sensibles à l'oxydation ou à la chaleur doivent être formulés séparément et additionnés ultérieurement par filtration aseptique (membrane filtrante de 0,22 µm). Préparer la suspension bactérienne pour s'assurer que l'activité bactérienne est conforme et que la concentration est conforme aux exigences d'inoculation.
Raccordements et scellement des lignes: raccordez les lignes selon le processus de fermentation – le tuyau d’admission relie le système d’air stérile, le tuyau d’échappement accède au dispositif de condensation et au système de traitement des gaz d’échappement, le tuyau de remplissage relie le flacon de remplissage stérile et le tuyau de prélèvement est équipé d’une vanne de prélèvement stérile. Serrez chaque écrou d'interface après la connexion pour assurer une étanchéité étanche (qui peut être vérifiée par des tests de pression ultérieurs) et éviter les fuites d'air ou l'intrusion de bactéries parasites pendant la fermentation.
(II) Mise en service de l'équipement: paramètres de réglage précis
Mise en service à vide: mise sous tension de l'alimentation totale du fermenteur, démarrage du système de contrôle, test séquentiel du système d'agitation (réglage de la vitesse de rotation à 50 - 100 tr / min, observation de la stabilité du fonctionnement de la palette d'agitation), du système de contrôle de la température (réglage de 37 ° C, vérification du démarrage et de l'arrêt normaux du module de chauffage ou de réfrigération), du système de contrôle du pH (étalonnage de l'électrode de pH avec un tampon standard, assurez - vous que l'erreur de lecture est ≤ ± 0,05), du système de contrôle de l'oxygène (étalonnage de l'électrode d'oxygène, observation de la sensibilité des
Remplissage du milieu de culture avec paramètres prédéfinis: le milieu de culture formulé est injecté dans le fermenteur à travers un entonnoir stérile, la charge est contrôlée à 50% - 70% du volume utile du réservoir (pour éviter le débordement de mousse ou le manque d'oxygène dissous pendant la fermentation). Après la fermeture de l'orifice d'injection, les paramètres de base sont prédéfinis dans le système de contrôle: température (par exemple, bactéries 37 ° C, champignons 28 ° c), vitesse d'agitation (50 - 300 tr / min selon les besoins de la souche), débit d'air (généralement 0,5 - 2 vvm, c'est - à - dire 0,5 - 2 volume d'air stérile par volume de milieu et par heure), pH (par exemple, bactéries 7,0 - 7,2, levures 4,5 - 5,5) et stratégie de remplissage (temps de remplissage, taux de remplissage).
(III) opérations de fermentation: surveillance et régulation dynamiques
Opération d'inoculation: l'inoculation est réalisée avec une technique d'opération aseptique - l'embouchure de semence est désinfectée par essuyage alcoolique, la suspension de la souche est injectée rapidement dans le réservoir après l'ouverture de l'embouchure d'inoculation, et l'écrou de l'embouchure d'inoculation est serré immédiatement après l'injection. Le processus d'inoculation doit être rapide et réglementé pour éviter l'introduction d'hétérocytes pendant des périodes d'exposition à l'air trop longues.
Surveillance et réglage des paramètres: enregistrement de la température toutes les 1 heure au début de la fermentation, pH、 Oxygène dissous, vitesse de rotation de l'agitation et d'autres paramètres, après stabilisation peut être prolongée à 2 - 4 heures pour enregistrer une fois. Régulation dynamique en fonction des variations de paramètres: réglage par le module de chauffage ou de réfrigération lorsque la température s'écarte de la valeur de consigne; Supplémentation en ammoniaque stérile ou en solution de NaOH lorsque le pH diminue et en acide chlorhydrique stérile ou en acide organique lorsque le pH augmente; Lorsque l'oxygène dissous est trop faible, il peut augmenter la vitesse de rotation de l'agitation, augmenter le débit d'aération ou passer à l'oxygène pur; Lorsque de grandes quantités de mousse apparaissent, ajoutez manuellement un agent anti - mousse stérile ou démarrez le système anti - mousse automatique.
Échantillonnage et détection: selon les besoins de l'expérience, la vanne d'échantillonnage est désinfectée avec de l'alcool et une petite quantité de ferment est libérée pour rincer la ligne avant de prélever l'échantillon. Les échantillons doivent être testés en temps opportun pour la concentration bactérienne (par exemple, od600), la teneur en métabolites (par exemple, chromatographie liquide à haute performance), les composants résiduels du milieu de culture, etc., afin de fournir une base pour le jugement du processus de fermentation et l'ajustement des paramètres.
(IV) fin de fermentation: arrêt et nettoyage normalisés
Opération d'arrêt: lorsque la fermentation atteint un point final prédéfini (par exemple, le pic de concentration bactérienne, la production maximale de produits métaboliques), éteignez d'abord le module de chauffage / réfrigération, le système d'agitation et le système de ventilation, puis coupez l'alimentation électrique totale. Ouvrez lentement la soupape d'échappement pour décompresser et après que la pression à l'intérieur du réservoir à être abaissée à la pression normale, ouvrez l'orifice de sortie pour collecter le liquide de fermentation.
Nettoyage préliminaire: vider le ferment résiduel dans le réservoir à temps, rincer l'intérieur du réservoir avec de l'eau du robinet, agiter la palette et la surface de la sonde, éliminer la fixation bactérienne évidente et les résidus de milieu de culture. Pour le système de ligne, il peut être rincé par l'eau du robinet à haute pression pour assurer l'absence d'accumulation de liquide résiduel.
II. Processus de stérilisation de fermenteur en acier inoxydable de laboratoire
La contamination par des bactéries diverses est l'une des principales raisons de l'échec de l'expérience de fermentation, la stérilisation du fermenteur en acier inoxydable de laboratoire doit suivre le principe de « couverture complète, élimination complète», le noyau est destiné au réservoir, au milieu de culture, aux lignes et aux accessoires pour la stérilisation, la méthode commune est la stérilisation à la chaleur humide (stérilisation à la vapeur à haute pression), des scénarios spéciaux peuvent être associés à la stérilisation à la chaleur sèche ou à la stérilisation chimique.
Préparation avant stérilisation: inspection et prétraitement
Inspection de l'équipement et de la ligne: vérifiez que les joints du fermenteur (tels que les joints en silicone) ne vieillissent pas et que l'interface de la ligne n'est pas desserrée; Vérifiez que le niveau d'eau du pot stérilisé est conforme à la norme, la soupape de sécurité, la soupape d'échappement fonctionnent correctement. Pour les composants qui ne résistent pas aux températures élevées (p. ex., électrodes de pH partielles, électrodes à oxygène dissous), il est nécessaire de les retirer à l'avance et de les remplacer par des bouchons spéciaux pour la stérilisation ou par un traitement aseptique séparé.
Pré - traitement du réservoir et de la ligne: rincer le réservoir et la ligne avec de l'eau désionisée pour éliminer les résidus de détergent ou d'impuretés. Après avoir injecté le milieu à l'intérieur de la cuve, allumer la palette d'agitation et agiter pendant 5 à 10 minutes, en veillant à ce que le milieu soit réparti uniformément et en évitant que l'agglomération locale affecte l'effet de stérilisation.
(II) Méthode de stérilisation de base: opération de stérilisation par chaleur humide (couramment utilisée)
La stérilisation par chaleur humide utilise la vapeur haute pression à haute température (121 ℃) et à haute humidité pour tuer les micro - organismes et les germes, applicable aux réservoirs, aux milieux de culture, aux lignes et autres composants résistants aux températures élevées, le processus spécifique est le suivant:
Étanchéité et admission d'air: Fermez toutes les ouvertures du fermenteur (orifice d'alimentation, orifice d'échantillonnage, orifice de sortie), serrez les écrous d'interface pour assurer l'étanchéité du réservoir. Connectez le tuyau d'échappement, le tuyau d'admission du fermenteur à la cuve de stérilisation ou au générateur de vapeur de stérilisation spécial, ouvrez la soupape d'admission, passez lentement dans la vapeur et excluez l'air froid dans le réservoir et dans les lignes (les résidus d'air froid peuvent entraîner une température locale insuffisante et une stérilisation incomplète).
Boost & Conservation de la chaleur: après que le tuyau d'échappement à évacuer la vapeur uniforme en continu (sans l'inclusion d'air froid), fermez la soupape d'échappement et commencez à augmenter la pression. Lorsque la pression à l'intérieur de la cuve atteint 0,1 MPa (pression manométrique), la température atteint 121 ° C, maintenir cette pression et la température pendant 30 - 60 minutes (ajustement selon la composition du milieu de culture: prolonger à 60 minutes avec des composants difficiles à stériliser tels que l'amidon, les protéines, etc., 30 minutes de milieu commun est suffisant). La pression et la température sont étroitement surveillées pendant le processus de stérilisation, si la pression diminue, il est nécessaire de remplacer la vapeur à temps.
Réduction de pression et refroidissement: après la fin de la stérilisation, commencez par ouvrir lentement la soupape d'échappement pour décompresser, lorsque la pression à réduire à 0,02 MPa, ouvrez le système de refroidissement (par exemple, le refroidisseur d'eau) pour refroidir le réservoir. Lorsque la température à l'intérieur de la cuve descend à 40 - 50 ° C (pour éviter l'inactivation de la souche causée par un ensemencement trop chaud et la coagulation du milieu causée par un ensemencement trop faible), la pression chute à la pression normale, éteignez le système de refroidissement et préparez - vous à l'ensemencement.
(III) mode de stérilisation auxiliaire: adaptation à des scénarios spéciaux
Stérilisation à la chaleur sèche: pour les composants qui ne peuvent pas être stérilisés à la chaleur humide (par exemple, les cuillères d'échantillonnage en métal, les accessoires à l'intérieur de la table d'opération stérile), mettre dans une boîte de stérilisation à la chaleur sèche, stériliser à 160 - 180 ℃ pendant 2 - 3 heures, après la stérilisation refroidir naturellement à la température ambiante pour la sauvegarde.
Stérilisation chimique: pour les canalisations ou les surfaces qui ne résistent pas aux températures élevées (p. ex., des parties de canalisations en plastique, des sondes de capteur), désinfecter ou tremper pendant 30 minutes avec de l'alcool à 75%, puis rincer avec de la saumure physiologique stérile pour éliminer l'alcool résiduel et éviter l'inhibition de la souche par des agents chimiques.
Stérilisation du système d'air stérile: l'air entrant dans le processus de fermentation doit être stérile et peut être traité par stérilisation à haute température (chauffage de l'air à 121 ° C pendant 30 minutes) ou par filtration à cartouche (avec cartouche stérile de 0,22 μm), ce qui garantit que l'air entrant dans le réservoir est exempt d'impuretés.
Iv) Vérification et entretien après stérilisation
Vérification de l'effet de la stérilisation: peut être vérifiée par la « méthode de culture à blanc» - pas d'inoculation après la stérilisation, placez le fermenteur à la température de fermentation définie pour la culture pendant 24 à 48 heures, si le milieu de culture n'est pas trouble et ne pousse pas de germes, indiquant que la stérilisation est qualifiée; Des indicateurs biologiques (tels que Bacillus lipophila thermophilus) peuvent également être utilisés, des indicateurs de culture après stérilisation, si l'indicateur ne change pas de couleur, la stérilisation est qualifiée.
Réinitialisation et conservation des composants: après la stérilisation, les sondes qui seront retirées à l'avance (p. ex., pH, électrodes oxygénées) seront installées après rinçage avec de la saumure physiologique stérile pour assurer l'étanchéité de l'interface. Le fermenteur qui n'est pas immédiatement utilisé, doit garder le réservoir sec, peut passer dans l'air stérile pour sécher l'intérieur, après avoir fermé toutes les ouvertures pour la sauvegarde.
Iii. Opérations et stérilisation considérations clés
Priorité à la sécurité: il est strictement interdit d'ouvrir le réservoir ou la casserole de stérilisation non autorisée pendant la stérilisation, il est nécessaire d'opérer lentement lors de la décompression, d'éviter une chute de pression provoquant l'ébullition du milieu de culture; Lors de l'utilisation du système d'agitation, il est interdit de pousser les mains ou les outils à l'intérieur du réservoir pour éviter les dommages mécaniques.
Opération stérile tout au long du processus: l'inoculation, l'échantillonnage, le réapprovisionnement et d'autres liens doivent être effectués dans la table d'opération stérile, le personnel d'exploitation doit réglementer le port de vêtements stériles, gants, masques pour éviter l'introduction artificielle de bactéries diverses.
Entretien périodique de l'équipement: vérifiez le vieillissement des joints du fermenteur tous les mois, Remplacez - les à temps; Calibrer le capteur de température, l'électrode de pH, l'électrode d'oxygène et le manomètre tous les 3 à 6 mois pour assurer une détection précise des paramètres; Nettoyez le réservoir à temps après la stérilisation pour éviter que le milieu de culture ne corrode la paroi interne en acier inoxydable.
Enregistrement complet des paramètres: enregistrement détaillé de la température pendant le fonctionnement, pH、 Des paramètres tels que l'oxygène dissous, la vitesse de rotation de l'agitation, ainsi que des informations telles que la pression, la température, le temps de conservation de la chaleur pour la stérilisation fournissent une base pour la répétition des expériences et la résolution des problèmes.
Variété,Fermenteur de laboratoire en acier inoxydableLe processus d'exploitation et de stérilisation doit suivre le principe de base de « contrôle de précision, garantie de stérilité». La spécification du processus opérationnel peut assurer la stabilité des paramètres de fermentation, améliorer la répétabilité expérimentale; Un processus de stérilisation rigoureux peut éviter la contamination par des bactéries à la source et garantir le succès de l'expérience. En maîtrisant les processus et les précautions ci - dessus, vous pouvez tirer pleinement parti de la valeur expérimentale du fermenteur et fournir un soutien fiable à la recherche microbiologique et aux expériences de bio - ingénierie.