Le spectromètre à flux arrêté est une technique d'analyse utilisée pour étudier la cinétique des réactions rapides, dont le cœur consiste à réaliser un mélange rapide des réactifs avec un arrêt instantané de l'écoulement et à surveiller l'évolution de la réaction en temps réel grâce à un signal optique. Voici un exposé détaillé de son fonctionnement et des détails de son utilisation:
I. principe de fonctionnement
Système de mélange rapide: l'unité de mélange d'un spectromètre à flux arrêté est généralement entraînée par deux seringues ou un dispositif pneumatique qui mélange les deux réactifs, tels que les réactifs a et B, à grande vitesse à travers une buse ou une chambre de mélange. Le temps de mélange peut être aussi court que 0,5 milliseconde, assurant le démarrage de la réaction dans des conditions homogènes.
Système de détection optique: la solution mélangée s'écoule dans la cellule d'observation et le système optique enregistre les changements d'Absorbance, de fluorescence ou de signal diffusé en temps réel via une source de lumière (visible ou ultraviolette), un monochromateur (sélection d'une longueur d'onde spécifique) et un détecteur (par exemple, une photodiode ou un CCD). La résolution temporelle peut atteindre l'ordre de la microseconde (10 μs - 10 MS), capturant les intermédiaires transitoires ou la dynamique des réactions rapides.
3. Contrôle résolu dans le temps: mélange synchrone avec détection optique par le déclencheur, après que la réaction cesse de couler, la courbe de changement du signal au fil du temps est enregistrée en continu, de sorte que les paramètres cinétiques tels que la constante de vitesse de réaction, l'énergie d'activation et autres sont déduits.
II. Détails d'utilisation
1. Préparation de l'échantillon: les réactifs doivent être formulés à l'avance dans un tampon approprié et filtrés à travers une membrane filtrante de 0,22 μm pour éviter que les particules ne bloquent la buse. Pour les échantillons protéiques ou enzymatiques, un pré - refroidissement à 4 ° c est nécessaire pour maintenir l'activité.
2. Paramètres
- Rapport débit / mélange: ajustez la vitesse de bolus de la seringue (par exemple 18,5 μl / MS) en fonction de la vitesse de réaction pour assurer un mélange homogène.
- sélection de la longueur d'onde: réglage de la longueur d'onde caractéristique (par exemple, pic d'absorption des protéines 280 nm) via un monochromateur avec un pas minimum jusqu'à 0,1 nm.
- fenêtre temporelle: réglez la période de détection (par exemple, de l'ordre de la milliseconde à la seconde) en fonction de la durée de la réaction pour éviter de manquer des signaux intermédiaires critiques.
3. Acquisition de données: après le déclenchement du mélange, le système enregistre automatiquement la courbe de variation de l'Absorbance ou de l'intensité de fluorescence au fil du temps. Plusieurs répétitions de l'expérience (généralement ≥ 3) sont nécessaires pour améliorer le rapport signal sur bruit et déduire un témoin vierge (par exemple, la ligne de base du tampon).
4. Maintenance des instruments
- processus de nettoyage: rincer la ligne immédiatement après l'expérience avec de l'eau désionisée, puis éliminer les protéines résiduelles ou les précipités minéraux avec une solution à faible concentration d'acide nitrique ou d'hydroxyde de sodium.
- Étalonnage régulier: Vérifiez l'intensité de la source lumineuse, la sensibilité du détecteur et la cohérence du temps de mélange, en particulier après une utilisation prolongée.
- entretien de la cellule d'échantillonnage: la cellule d'observation (par exemple, un volume de 20 μl) doit être maintenue propre et éviter que des bulles ou des rayures n'affectent le chemin optique.
5. Précautions
- homogénéité du mélange: les échantillons complexes peuvent être pré - boostés ou utiliser une chambre de mélange à vortex pour réduire le gradient de diffusion].
- contrôle du volume mort: la conception de la ligne doit minimiser le volume résiduel (généralement < 10 μl) et prévenir la contamination croisée.
- influence de la température: le système de contrôle de la température doit maintenir la température de la cellule de réaction constante (par exemple ± 0,1 ° c) pour éviter les fluctuations thermiques qui interfèrent avec la vitesse de réaction.