Dans le monde des microplaques, la lumière est une règle, etFiltre d'étalonnage enzymatiqueC'est l'échelle. L'étalon enzymatique « pose des questions» par une longueur d'onde spécifique et l'échantillon « répond» par Absorbance ou fluorescence. Derrière les valeurs apparemment simples, il y a un ensemble de « longueurs d’onde de base» vérifiées à plusieurs reprises qui, comme des échelles sonores internationales, permettent de traduire les données de différentes marques et de différents laboratoires. Comprendre l'origine et l'utilisation de ces longueurs d'onde est la première étape pour concevoir des expériences et détecter les anomalies.
Les « trois anciens termes » de l’absorbance visible occupent encore 90% de la journée: 405 nm, 450 nm, 620 nm. 405 nm provenant de l'absorption maximale du P - nitrophénol (PNP) dans le substrat de la phosphatase alcaline (ALP), lecture de base du système ELISA Golden scalepar; 450 nm correspond alors au produit final de la peroxydase de raifort (HRP) qui catalyse le rendu des couleurs du TMB et devient presque la « monnaie universelle» en immunodétection. Quant à 620 nm, ce n'est pas le pic de l'échantillon, mais le fond bleu laissé après la terminaison du TMB, qui a été utilisé pour corriger les blancs, en déduisant les rayures au fond de la plaque de la différence de pipetage, améliorant le CV du lot à < 5%.
Lorsque les expériences entrent dans l'évaluation du métabolisme ou de la viabilité cellulaire, la longueur d'onde est immédiatement décalée vers le rouge. 490 nm et 570 nm appariés permettant de lire séparément les produits MTS et MTT - form臜; Les producteurs ont contrôlé la demi - Largeur de bande du filtre à 10 nm pour éviter les interférences mitochondriales avec la flavine. Pour détecter la libération de lactate déshydrogénase (LDH) par des dommages membranaires, passez à 340 nm pour surveiller le taux d'oxydation du NADH, cette longueur d'onde est sensible à la température, l'instrument nécessite un module thermostatique intégré ≤ 0,1 ℃ pour garantir la linéarité de Δod min⁻¹.
Les longueurs d'onde de base pour les applications de fluorescence sont plus étudiées pour le « déplacement de stokes». Excitation 485 nm / émission 528 nm est une "combinaison d'or" de fluorescéine (FITC), largement utilisé pour l'adhésion cellulaire avec des marqueurs d'anticorps; Lors de l'amélioration du flux, un système APC - Cy5 couramment excité à 630 nm et émis à 670 nm, évitant la fluorescence spontanée du milieu de culture, peut encore atteindre une sensibilité de 0,2 fmol par well dans une plaque de 384 puits. Pour la quantification des acides nucléiques, l'excitation 260 nm / émission 380 nm nécessite une fibre de quartz et un filtre de classe UV, empêchant le vieillissement UV profond d'entraîner une atténuation de la perméabilité.
Maintenance, bien que ces filtres soient recouverts d'un film dur et aient une durée de vie de plusieurs dizaines de milliers de fois, mais les empreintes digitales de surface ou les résidus d'éthanol diffuseront le chemin optique, ce qui augmentera la do vierge de 0,01, ce qui entraînera une erreur de calcul de l'échantillon de valeur élevée comme « dépassement». Par conséquent, l'essuyage quotidien avec un chiffon sans peluche + de l'eau pure et l'étalonnage de longueur d'onde une fois par an sont la base mais la clé sop.
En un mot, la longueur d'onde de base n'est pas un nombre aléatoire, mais une "Interface Standard" qui co - évolue avec des substrats chimiques, des biomolécules. En les maîtrisant, l'étalon enzymatique peut vraiment devenir un "spectrophotomètre dans une microplaque", donnant à chaque 0001 od une signification scientifique reproductible.