Système d'imagerie microscopique confocale par fluorescence proche infrarouge

Dans les domaines de la recherche scientifique tels que la biomédecine, la science des matériaux, les dispositifs optoélectroniques et le génie biomédical, les échantillons cibles (tels que les tissus profonds de petits animaux vivants,NIR-IIPoints quantiques/Microstructure de pérovskiteCellules marquées par sonde fluorescente bio - ciblée) présentent souvent une évolution dynamique, multi - structureNiveau hiérarchique etCaractéristiques complexes sensibles à l'environnement, leurs propriétés de base (telles que la profondeur d'imagerie tissulaire, l'uniformité de la luminescence des matériaux, l'efficacité du ciblage de la sonde) et la distribution spatiale, la dynamique temporelle et la lumière-Les interactions de matière sont étroitement liées. La technologie d'imagerie unique traditionnelle n'obtient des informations qu'à partir d'une seule dimension, difficile à percer « limites de l’imagerie superficielle » Avec « interférence de fond élevée » Double goulot d'étranglement, ne peut pas être résolu complètementNIR-IILes bandes ont des besoins d'imagerie profonds et à haute résolution. Tandis que le système d'imagerie microscopique confocale de fluorescence à deux zones proche infrarouge par intégrationNIR-IIAvantages de bande, capacité de résolution spatiale confocale et fonction de surveillance dynamique in situ, permettant une analyse d'imagerie complète des échantillons, de la microstructure submicronique aux tissus profonds de plusieurs millimètres, est devenue une percéeNIR-IITechnologies de base pour l'étude des goulots d'étranglement dans les systèmes complexes connexes.

Toute non -NIR-IILa technologie d'imagerie de la bande ou le mode non Confocal, il existe des limites intrinsèques à la capacité d'imagerie profonde et à la résolution spatiale, ne peut refléter que certaines propriétés de l'échantillon, ne peut pas être capturé complètementNIR-IIBesoins de recherche de base dans le domaine. Par exemple, l'imagerie confocale de la lumière visible, bien qu'elle ait une résolution spatiale submicronique, mais en raison de la forte diffusion et de l'absorption de la lumière visible par les tissus biologiques, pénètre à des profondeurs de seulement quelques centaines de microns, il est difficile de couvrir les tissus profonds tels que le cerveau et Le foie de souris;NIR-IImagerie par fluorescence (700 à 900 nm), bien que la profondeur de pénétration soit légèrement augmentée, elle reste limitée àAbsorption généralisée de fréquence tissulaire, le bruit de fond est significatif et ne permet pas de distinguer clairement les limites tumorales des tissus normaux; Champ large ordinaireNIR-IIL'imagerie peut être utilisée « fenêtre bio - optique » (1000 à 1700 nm), la pénétration de plusieurs millimètres est réalisée, mais il n'y a pas de capacité de chromatographie spatiale confocale pour localiser les structures submicroniques (telles que les branches capillaires) dans les tissus profonds; L'imagerie par fluorescence transitoire, bien que capable de capturer la dynamique de la luminescence, ne peut pas être corréléeNIR-IIDistribution spatiale profonde des bandes – – Cela nécessite l'aide d'un système d'imagerie microscopique confocale par fluorescence à deux zones dans le proche infrarouge, par « leNIR-IIBande basse diffusionLe +Confocation haute résolution » Avantages synergiques pour combler les lacunes critiques dans l'imagerie profonde à haute résolution, Z - major est complémentaire avec d'autres technologies.(références:Schmidt et al.,Nat Rev Methods Primers 4, 23 (2024).) et

Figure1. Imagerie par fluorescence proche infrarouge à deux zones

Dans le domaine de la détection optique de l'information, les systèmes d'imagerie microscopique confocale par fluorescence à deux zones dans le proche infrarouge intègrent souvent la régulation de l'environnement in situ (température, humidité, atmosphère gazeuse, adaptation d'échantillons biologiques vivants) avec des fonctions d'association de données multimodales (acquisition synchrone de l'intensité de fluorescence, images de chromatographie spatiale, signaux lumineux résolus dans le temps) via une ouverture numérique élevéeNIR-IIObjectif dédié focalisation excitation lumineuse, trou d'épingle filtre la lumière de fond hétéroclite pour assurer dans un espace unifié-Acquisition synchrone de la distribution de fluorescence 3D de l'échantillon avec des données d'évolution dynamique sous le système de coordonnées de profondeur, évitant efficacement la détection étape par étape traditionnelle "Désalignement structurel dû au déplacement de l'échantillon" "extinction par fluorescence induite par des changements environnementaux" Attendez les questions. En raison des tissus biologiquesNIR-IIDiffusion et absorption de la lumière uniquement visible1 / 10 - 1 / 5Et le systèmeAvoir faiblePhototoxicité (réduction des dommages à la lumière tissulaire) pouvant être résolue en temps réel « la lumière- NIR-IILa sonde-Organisation biologique » InterdimensionnelMécanisme d'interaction – – Par exemple, dans l'imagerie cérébrale de souris vivantes, le diamètre capillaire, la distribution de la vitesse du flux sanguin à des profondeurs de plusieurs millimètres peuvent être clairement présentés; DansNIR-IIQuantiqueMicro et Nanostructures ponctuellesEn caractérisation, localisable submicroniqueZone de niveauDéfaut de Luminescence. Cette stratégie de fusion in situ n'est pas seulementNIR-IIMicro - nanomatériauxLes mécanismes de Luminescence interfaciale, les fonctions physiologiques des tissus biologiques (par exemple, la néovascularisation tumorale) et d'autres études mécanistes microscopiques fournissent des preuves directes, également par le biais de « Dynamic MonitoringLe +Chromatographie profonde » La combinaison de technologies a jeté les bases méthodologiques fondamentales pour révéler les lois d'action inter - échelles de systèmes complexes tels que le microenvironnement tumoral interagissant avec des sondes.

La valeur fondamentale des systèmes d'imagerie microscopique confocale par fluorescence à deux zones dans le proche infrarouge ne réside pas seulement dans « leNIR-IIAvantages de la bandeLe +Capacité de résolution confocale » L’application Collaborative réside plus dans sa production « espace-Profondeur-Le temps » Couplage profond des données d'imagerie multidimensionnelle avec résolution intelligente. Cette fusion fait une percée dans les techniques d'imagerie traditionnelles "Limites superficielles" "résolution-Compromis de profondeur de pénétration » de « Data Island » Le problème, en établissant « Sample emptyDistribution inter-Réponse organisationnelle profonde-Evolution dynamique dans le temps » Modèle d'association inter - échelle permettant une perception holographique des systèmes complexes – – Par exemple, dans le diagnostic des tumeurs, l'emplacement spatial des limites de la tumeur, l'état d'approvisionnement en sang des vaisseaux sanguins profonds et la cible de la sonde peuvent être obtenus simultanément.Vers l'UnionEfficacité; DansNIR-IIDans la caractérisation des matériaux, l'intensité lumineuse des microzones peut être associée à l'uniformité de la structure cristalline. En particulier dans le contexte actuel du développement rapide de l'intelligence artificielle et de l'apprentissage en profondeur, les données d'imagerie à grand débit générées par le système (telles que les cartes de fluorescence 3D des tissus vivants, les courbes dynamiques de Luminescence des microrégions de matériaux) combinées à des algorithmes d'apprentissage en profondeur peuvent permettre l'identification automatique des zones tumorales, l'analyse quantitative des paramètres hémodynamiques,NIR-IIPositionnement intelligent des défauts matériels, il va certainement briser l'existant « experience Driven » Le paradigme de l'imagerie et de la caractérisation, l'entrée dans la data - drivenNIR-IINouvelle phase de la recherche scientifique.

Cas d'application:

1. Temps-videintervalle-Energie multidimensionnelle analyse dynamique profonde des tissus biologiques et mécanismes moléculaires

Proche infrarouge 2 (NIR-II,1000 à 3000 nm) bandeOrganisation basseAvantages intrinsèques de la diffusion, de la faible autofluorescence et du spectre résolu en temps et de l'espace réel (r-espace), l'imagerie combinée permet d'atteindre des tissus biologiquesNIR-IIAnalyse systématique des propriétés d'émission des sondes fluorescentes à différents retards temporels, à différentes positions spatiales, à différentes énergies (longueurs d'onde), révélant ainsi en profondeur la dépendance du signal de la sonde aux processus biologiques. L'idée centrale de l'imagerie par fluorescence proche infrarouge à deux zones est de « Time Delay » Avec « type de sonde/Paramètres d'excitation » En tant que variable clé, par InGaAs Le détecteurIntermédiaireChamp large du Guide/Co - focus/Système d'imagerie optique et porte électroniqueContrôle du tempsTechnologie de résolution, mesure précise de trois catégories dans différentes conditionsNIR-IIDifférences dans l'intensité lumineuse, la longueur d'onde d'émission et la distribution spatiale des sondes (nanoparticules inorganiques, molécules organiques, protéines génétiquement modifiées), construction de signaux de sonde dans le temps-Espace (t-rCarte de distribution dynamique dans l'espace). Comparer avec la lumière visible traditionnelle/ NIR-IImagerie (Focus uniquementStructure statique peu profonde et intensité lumineuse macroscopique),NIR-IIL'imagerie par fluorescence fournit non seulement des informations sur l'évolution dynamique de la sonde (par exemple, la vitesse du flux sanguin, la trajectoire de clairance du médicament) avec une localisation spatiale profonde, mais reflète également les lois de diffusion induite par la lumière à l'intérieur des tissus biologiques, l'efficacité de la liaison de la sonde à une cible biologique et le rapport signal / bruit de l'inhibition de l'autofluorescence.SNR), l'effet ascensionnel.(références:Nat Rev Methods Primers 4, 23 (2024).) et

Figure2. Dans la tumeurCD8Le +TCellules (rouge), spécificité de l'antigène de la LeucineTCellules (vert) etpernp-ovacase- BCytosine-Acide phosphorique-Guanine (CpG B) trois dimensions du nanovaccin (bleu) (3D) ReconstructionNIR-IIImages[1]

Pour aller plus loin, si l'axe de l'énergie est introduit sur la base de la résolution temporelle et de l'imagerie spatiale (E, c'est - à - dire la longueur d'onde d'émission de la sonde), peut être retardée par le temps (t), position spatiale (r) avec énergie Photonique (E), un espace tridimensionnel composé (t-r-ECartographie de la distribution d'émission du signal de sonde dans l'espace de phase), c'est - à - direJe (t, r, E) etAtlas. Ce type de cartographie permet aux chercheurs de suivre simultanément les lois de l'évolution temporelle de la sonde (par exemple, le mouvement du Front de circulation sanguine, le vieillissement du transport lymphatique), les caractéristiques de distribution spatiale (par exemple, les zones d'agrégation ciblées par la tumeur, les branches vasculaires profondes) et les propriétés d'adaptation énergétique (par exemple, les longueurs d'onde d'émission etNIR-IIDegré d'appariement des sous - régions), révélant différentes sondes-Origine sélective de l'émission de signaux dans l'état d'interaction biologique. Par exemple, dans l'imagerie des tissus biologiques vivants, différents temps, espace et énergieNIR-IILes signaux de sonde présentent des différences significatives:la FDAApprouvéICGAvec la queueLe lancement s'étend àNIRIIa Zone (1300 à 1400 nm), Sub - millimétrique localisable en temps réel dans la chirurgie des tumeurs du foie humainTransfert de niveauFocus (résolution spatiale ~2 des μm), peut suivre post - opératoire dans la dimension temporelle 24 Dynamique de clairance hépato - rénale de la sonde en heures;NaYbF4 : ErNanoparticules de terres rares (RENPs) lancementNIR-IIb de 1550 nmSignal de bande, toujours maintenu après pénétration dans le crâne complet de la sourisSNR > 10, spatialement clairement distinguer les artères cérébrales (rouge) des veines (bleu) branches, énergie correspondant à la fenêtre de minimisation de la diffusion tissulaire, le temps de passer> 20Cadre/L'imagerie dynamique en secondes capture les fluctuations du flux sanguin induites par le cycle cardiaque;CH-4T@Emission de complexes protéiquesNIR-II de 1000 nmSignal, disponible en imagerie lymphatique avec sonde vasculaire (DCNPs,1060 nm), formant une imagerie bicolore, différenciant spatialement avec précision les ganglions inguinaux du réseau vasculaire environnant, traçant temporellement le processus de transport de la sonde de l'injection intradermique aux ganglions lymphatiques (~ 30Minutes jusqu'au sommet);NIR-IIImagerie par fluorescence disponible pour la décisionRENPsPour "Sonde prioritaire pour l'imagerie des tissus cérébraux profonds" (adaptationNIR-IIbFenêtre de faible diffusion),ICGPour « Clinical Translation Priority Probe » (la FDAAttributs approuvés), tout en identifiant la loi d'atténuation de l'autofluorescence tissulaire croissante avec la longueur d'onde (> 1300 nmNégligeable) déclenchéSNREffet d'élévation.

2. Points quantiquesLa sondePréparation etNIR-IIApplications de bio - Imagerie profonde

Région proche infrarouge II (NIR-II,1000 à 1700 nm) imagerie fluorescente grâce àOrganisation basseLes avantages uniques de la diffusion, faible autofluorescence, montrent un grand potentiel dans le domaine de l'imagerie à haute résolution des tissus profonds et deviennent une direction de recherche importante pour l'imagerie biomédicale. Cependant, l'existantNIR-IILes fluorophores (tels que les colorants organiques, les nanotubes de carbone, les nanocristaux de terres rares) présentent généralement des problèmes de faible rendement quantique, de mauvaise stabilité chimique ou de biocompatibilité insuffisante; Bien que PbS Points quantiques (QD), avec un rendement quantique élevé (jusqu'à60%), mais ses métaux lourds (Pb²⁺), toxicité des fuites,S²⁻Un défaut de stabilité optique résultant d'une oxydation facile, limitant fortement son application en imagerie vivante. Ces dernières années,PbS@CdS Structure de la coquille nucléaireQDPar CDS Le shell a été amélioré initialementPb²⁺Problème de fuite, et SiO₂Avecla FDAApprouvéBiphiliePolymèresPluronique F-127Une stratégie de revêtement à double couche qui améliore encore la stabilité chimique et la biocompatibilité du matériau– –SiO₂La couche assure une isolation physique pour inhiber l'oxydation et les fuites ioniques,des F-127La couche confère solubilité dans l'eau et résistance à la bio - adsorption, en construisant PbS@CdS @SiO₂@F-127Nanoparticules (NPs), promet une percéeNIR-IISonde fluorescente“Haute luminosité-Haute stabilité-Faible toxicité » Goulots d'étranglement difficiles à jongler, offrant de nouveaux protocoles pour l'imagerie des tissus profonds tels que les vaisseaux sanguins du cerveau, le tractus gastro - intestinal, etc.

Dans cette étude, la quantité cible a été préparée en utilisant la méthode de microémulsion inverse, la modification de la greffe de surface et le procédé de dispersion par ultrasons.Sous - spot, et combiné avec un microscope électronique à transmission (TEM), diffusion dynamique de la lumière (DLS), état stable/Spectre de fluorescence transitoire, spectre d'absorption atomique (AAS) et InGaAs Système d'imagerie de caméra, le système révèle PbS@CdS @SiO₂@ des F-127 NPPropriétés optiques intrinsèques, stabilité chimique et propriétés d'imagerie biologique, il a été constaté qu'il a un rendement quantique élevé (~ 5,79%Beaucoup plus que la plupart des existantsNIR-IIFluorophore), largeLe pHGamme stabilité chimique (pH 1 à 13intérieur24 heuresVariations de fluorescence< 30%), faible toxicité interne et externe (Umuc3Les cellules 10 microgrammespar mLTaux de survie à la concentration> 90%), ainsi que l'élimination ultra - rapide du corps (après gavage gastro - intestinal4,5 hExcrétion avec les selles) et d'autres avantages; Ces améliorations de performance sont attribuées à SiO₂-F-127Synergie des structures à double couche– –SiO₂Shell isole physiquement l'oxygène de l'eau pour inhiberQDOxydation,des F-127dePEGLes segments de chaîne réduisent l'adsorption des protéines et augmentent la solubilité dans l'eau, tandis que les deux forment une enveloppe denseCouche efficaceBlocagePb²⁺/Cd²⁺Fuite, en même tempsntypeQDL'interaction interfaciale avec le revêtement optimise les caractéristiques d'émission de fluorescence.(références:Zebibulaet al.,Adv.Fonction- Mère. , 32: 2200386 (2022)) et

Figure3. Le même vaisseau cérébral de souris photographié à différentes profondeursNIR-IIImages fluorescentes

Résultats expérimentaux validement confirmés monocouche CDS Paire de Shell PbS Effet protecteur du nucléaire (réduitPb²⁺Taux de fuite) et SiO₂-F-127L'effet de levage du double revêtement sur la stabilité chimique, souligne PbS@CdS @SiO₂@ des F-127 NPNIR-IIPerformance d'imagerie: son pic d'émission est situé1155 nm(adaptéNIRIIa Fenêtre de faible diffusion), réalisée en imagerie vasculaire cérébrale de souris 950 des μm Visualisation claire du réseau vasculaire en profondeur,3DReconstruction des capillaires de la méningite discernables par l'image; En imagerie gastro - intestinale, pour 80 microgrammespar kgGavage à faible dose, peut être atteint3 à 5 mmSuivi dynamique des organes digestifs en profondeur (10 minutesContour de l'estomacEt,4,5 hDarcoli et excrété avec les selles),7 dAucun résidu dans le corps postérieur. Dans le même temps, ces résultats guident également directement le choix des paramètres expérimentaux de la sonde: la longueur d'onde d'excitation est déterminée pour785 nm(correspondance PbS@CdSQDHaute efficacité d'excitation), verrouillage de la fenêtre de détection d'imagerie1100 à 1700 nm(filtrage de la lumière parasite excitée); Parmi eux, différentsLe pHLa carte de variation de l'intensité de fluorescence dans les conditions fournit des preuves optiques directes de la stabilité chimique de la double enveloppe, tandis que l'évolution dynamique du signal de fluorescence en imagerie vivante (par exemple, fluctuations du flux sanguin cérébrovasculaire, trajectoire de migration de sondes gastro - intestinales) valide davantage la fiabilité de ce point quantique dans la surveillance dynamique des tissus profonds.

3. Biocompatible hydrosoluble infrarouge à ondes courtes (SWIR) Lancer des fleursL'écorceSynthèse de sondes fluorescentes et cancer du sein vivant multidimensionnelDegré moléculeApplications d'imagerie

Infrarouge à ondes courtes (SWIR,900 à 1400 nm) imagerie grâce àOrganisation basseLes avantages uniques de la diffusion, faible autofluorescence, montrent un grand potentiel d'application dans le domaine de la visualisation biomoléculaire des tissus profonds, en particulier pour fournir une nouvelle direction dans l'imagerie de précision des tumeurs solides telles que le cancer du sein. Cependant, actuellement disponible en clinique et en recherche scientifiqueSWIRLes sondes fluorescentes ont des limitations significatives: Transla FDAProche infrarouge approuvé (NIR) sonde indoleL'écorceVert (ICG), même si elle peut être étendue àSWIRémission en bande, mais longueur d'onde d'excitation limitée800 nmCi - dessous, seule l'imagerie monochromatique est prise en charge et les besoins de surveillance synchrone Multi - cibles ne peuvent être satisfaits; autreSWIRLes fluorophores (tels que les nanotubes de carbone, les points quantiques) sont confrontés à des problèmes de biocompatibilité, de solubilité dans l'eau insuffisante ou de synthèse complexe. Ces dernières années, sur la base deICGde π-Fleurs étendues conjuguéesL'écorceLes colorants sont préoccupants en raison de la forte modulabilité structurelle et de la haute sécurité biologique, parmi lesquelsICG-C9AvecICG-C11En augmentant plusieursChaîne nakawaNombre de doubles clés (respectivement ratioICGplus 1 un、2 unDouble liaison), réalisant le décalage vers le rouge de la longueur d'onde d'émission àSWIRBande de base, et s'appuie surICGLa base biocompatible du noyau parent, qui peut être optimisée pour la solubilité dans l'eau par modification de surface. Par ConstructionICG/ICG-C9/ICG-C11Sonde de base couplée à un anticorps, un marqueur d'apoptose ou un médicament anticancéreux, capable de synergieSWIRAvantages d'imagerie et capacité de reconnaissance ciblée pour la résolution multidimensionnelle des récepteurs de surface du cancer du sein, des vaisseaux sanguins tumoraux et des processus apoptotiques pourSWIRLa transformation clinique de l'imagerie moléculaire offre de nouvelles idées.(références:Mahadeva et al.,ACS Appl. Mère. Des interfaces. ,16, 17253−17266(2024).) et

Figure4. IndoleL'écorceVert (ICG),ICG-C9AvecICG-C11Propriétés optiquesLa caractérisation complexe comprend le spectre d'absorption, le spectre de fluorescence,Pic d'émission de fluorescence et rendement quantiqueEt durée de vie d'émission de fluorescence

Dans cette étude, la synthèse organique, l'homéostasie a été adoptée/Caractérisation spectrale transitoire et techniques d'imagerie in vivo, le système révèleICG-C9/ICG-C11Propriétés optiques intrinsèques de la sonde avec des propriétés de bio - imagerie, trouvé pour être précisSWIREmission en bande (phase aqueuse1 % de BSADans,ICG-C9lancer922 nmEt,ICG-C11lancer1010 nm), excellente biocompatibilité (HeLaLes cellules 10 μMTaux de survie à la concentration> 90%, dans le corps 4 Semaine foie reinIndicateurs fonctionnels normaux) et capacité d'imagerie stable (1 % de BSAIrradiation laser moyenne60 minutesTaux de Photoblanchiment< 30%), ces gains de performance sont attribués à π-Effet de décalage vers le rouge de longueur d'onde par extension conjuguée,BSAL'action combinée avec la sonde améliore la stabilité, ainsi que les fleursL'écorceHéritage du noyau mèreICG生物安全性。

Résultats expérimentaux validement confirmésICG-C9/ICG-C11de π-Structure d'extension conjuguée avecSWIRAssociation des caractéristiques d'émission (par augmentation 1 unDouble clé, décalage vers le rouge de la longueur d'onde d'émission ~à 100 nm), etNHSEster, MalaisieAcyleRéactifs de marquage imine, alcyne tri - classe vs anticorps (HerceptineEt,Erbitux),annexe VMédicaments anticancéreuxKadcylaLa capacité de couplage efficace, met en évidence cette catégorie de sondes multicoloresSWIRAdaptabilité à l'imagerie – – Par785 nm(ICG),905 nm(ICG-C9),975 nm(ICG-C11) excitation différenciée avec filtre de bande correspondante (900±25 nm、1000±25 nm、1100±25 nm), peut réaliser des glandes mammairescancerHER2/EGFRImagerie synchrone tricolore du récepteur avec les vaisseaux sanguins de la tumeur; Dans le même temps, ce résultat Guide également directement le choix de la combinaison de sondes pour l'imagerie de l'apoptose (ICG-KadcylaAvecICG-C9/IC11-annexe V) et paramètres de longueur d'onde pour la surveillance à long terme (ICG-C9-KadcylaAdoption905 nmInspirer,> 1000 nmDétection). Dont l'absorption à l'état stable/La spectroscopie de fluorescence confirme la sonde-Rétention des propriétés optiques après couplage des biomolécules, fluorescence transitoiredécompositionLa courbe (ICG-C9durée de vie2,7 nsEt,ICG-C11durée de vie7,1 ns) pourSWIRL'identification résolue en temps du signal fournit la preuve optique nécessaire, tandis que la distribution du signal par imagerie vivante valide le ciblage de la sonde.