Les problèmes courants qui peuvent survenir dans les expériences avec un système de traitement immunoblot entièrement automatisé de protéines comprennent principalement un signal faible ou nul, un fond élevé, un phénomène multibande, des anomalies de bande, etc. Voici une analyse détaillée de ces problèmes:
Signal faible ou aucun signal
Les anticorps un et deux ne correspondent pas: les anticorps deux et un doivent être de la même espèce que l'hôte un, par exemple un anticorps provient de la souris, le deuxième anticorps doit être un anticorps anti - murin.
Concentration insuffisante d'anticorps: utiliser des concentrations élevées d'anticorps et prolonger la durée d'incubation à 4 °C, par exemple une incubation d'une nuit.
Les agents bloquants réagissent de manière croisée avec les anticorps: utilisez un détergent doux tel que le Tween - 20, ou Remplacez les agents bloquants (par exemple, lait écrémé en poudre, BSA, sérum, gélatine).
Un anti - protéine ne reconnaissant pas l'espèce à tester: en se référant aux instructions, on compare la séquence immunogène et la séquence protéique, on s'assure que l'anticorps et la protéine d'intérêt réagissent et on établit un contrôle positif.
Quantité insuffisante d'échantillon sur la protéine: la quantité d'échantillon sur la protéine de chaque piste ne dépasse généralement pas 20 μg, un inhibiteur de protéase est utilisé et un contrôle positif est établi.
Transmembranage inadéquat: utilisez un colorant réversible pour détecter l'effet de transmembranage, vérifiez que l'opération de transmembranage est correcte, comme le film de PVDF doit être préalablement immergé dans le méthanol, puis dans le tampon de transfert.
Un anti - échec: utilisez des anticorps frais et évitez les réutilisations qui entraînent une diminution de la concentration efficace.
Inhibition du diacide par l'azide sodique: Évitez l'utilisation combinée de l'azide sodique et des anticorps marqués HRP.
Kit de détection expiré ou substrat inactivé: utilisez un substrat frais.
Fond élevé
Une fermeture spécifique n'a pas été réalisée ou une fermeture insuffisante: prolongation du temps de fermeture, remplacement d'un agent de fermeture approprié envisagé.
Une concentration trop élevée en anti - un ou deux: diluer l'anticorps à une concentration appropriée ou prolonger le temps d'incubation avec une dilution plus élevée de l'anticorps.
Le diacide se lie ou réagit de manière non spécifique avec l'agent bloquant: un contrôle diacide est établi (sans ajout d'un anti).
Lavage inadéquat des protéines non liées: augmentation du nombre de lavages.
Séchage de la membrane: empêcher la membrane de se dessécher pendant l'incubation, chaque étape doit garantir que la membrane a suffisamment de liquide réactif, peut être placé dans un agitateur constamment agité ou légèrement commotionné pour faire tremper la membrane dans la solution.
Mauvaise sélection des membranes: la membrane de nitrocellulose (membrane NC) a un fond inférieur à celui de la membrane PVDF et la membrane appropriée peut être choisie en fonction des besoins expérimentaux.
Phénomène Multi - bande
Le nombre de passages cellulaires est excessif et la protéine est exprimée différemment: les souches cellulaires originales non passées sont utilisées et des expériences de contrôle parallèles sont effectuées avec les souches cellulaires actuelles.
Les échantillons de protéines exprimés in vivo présentent de nombreuses formes modifiées: acétylées, méthylées, alkylées, phosphorylées, glycosylées, etc. des réactifs peuvent être utilisés pour déphosphoryler, déglycosyler les échantillons afin de mettre en évidence les modifications post - traductionnelles.
Dégradation de l'échantillon de protéine: ajouter suffisamment d'inhibiteurs de protéase dans le tampon de l'échantillon.
De nouvelles protéines non rapportées ou des protéines de la même famille de protéines avec des épitopes similaires et des structures différentes ont été détectées: consultez d'autres rapports de littérature ou utilisez Blast pour rechercher, en utilisant les souches cellulaires ou les tissus recommandés par les instructions.
Une concentration en anticorps trop élevée: diminution de la concentration en anticorps et / ou du temps d'incubation.
Anomalies de la bande
Le fond a des taches blanches inégales: il y a des bulles sur la membrane lors de la transmembranation ou les anticorps sont répartis de manière inégale sur la membrane, les bulles doivent être éliminées autant que possible pendant la transmembranation et les anticorps doivent rester agités pendant l'incubation.
Le fond a des taches noires: l'anticorps se lie à un agent bloquant qui peut être filtré.
Une bande blanche apparaît sur un fond profond: un ou deux anti sont ajoutés en excès et la concentration de l'anticorps doit être diluée.
Les bandes de destination sont colorées trop bas / trop haut, la séparation n'est pas radicale: les proportions de gel sont modifiées, les protéines de grand poids moléculaire sont collées à faible concentration, les protéines de petit poids moléculaire sont collées à forte concentration.
Effet « sourire » de la bande: une migration trop rapide ou une température d’électrophorèse trop élevée modifie le pH et la vitesse de migration, ce qui peut réduire la vitesse de migration ou l’électrophorèse cryogénique (par exemple, en chambre froide ou sur glace).
Des bandes hétérogènes apparaissent lors de l'hybridation de la même protéine: la gélification du gel est trop rapide lors de la préparation du gel, de sorte que la proportion d'Acrylamide dans la piste n'est pas uniforme, il est possible de se référer à la formulation du gel dans laquelle la quantité appropriée de TEMED est ajoutée et la quantité appropriée de SDS 1% (dilution dans l'eau) est ajoutée au Sommet du gel lors de la mise en place pour éviter que le gel ne sèche.