L'immunoblotting protéique entièrement automatisé (westernblotting) est une technique expérimentale largement utilisée dans la recherche biomédicale, cellulaire et moléculaire, principalement pour détecter la présence, la quantité d'expression et l'état modifié de protéines spécifiques. Cette technique combine la séparation électrophorétique et l'immunodétection, en utilisant des anticorps spécifiques pour reconnaître la protéine cible.
Principe de fonctionnement de base de l'immunoblotter de protéines entièrement automatique:
Préparation des échantillons:
Les protéines totales sont extraites des cellules, des tissus ou des fluides corporels, généralement en utilisant un tampon de lyse pour la lyse cellulaire.
Les protéines extraites sont quantifiées par des méthodes de détermination de la concentration en protéines telles que la méthode BCA ou Bradford.
Electrophorèse SDS - Page:
Le processus d'électrophorèse sépare les protéines de l'échantillon en fonction de leur poids moléculaire. Les immunoblottisseurs entièrement automatiques ont généralement une fonction d'électrophorèse automatisée et peuvent exécuter l'électrophorèse SDS - page de manière efficace et stable.
Une fois le processus d'électrophorèse terminé, les protéines migreront sur le gel en fonction de leur taille.
Tourner la membrane:
Les protéines séparées par SDS - page sont transférées sur une membrane de polyfluoroéthylène (PVDF) ou sur une membrane de nitrocellulose. Le processus de transmembranage utilise généralement une méthode de transfert électrique qui assure la fixation de la protéine sur la membrane.
Film fermé:
La membrane après transmembranage nécessite la fermeture des sites de liaison non spécifiques à l'aide d'un liquide de blocage (généralement une poudre de lait écrémé à 5% ou un tampon BSA), empêchant la liaison non spécifique des anticorps aux sites non ciblés sur la membrane.
Incubation des anticorps:
Les membranes sont incubées avec un anti (anticorps spécifique dirigé contre la protéine cible). Le temps d'incubation et la température doivent être ajustés en fonction des besoins en anticorps.
La membrane est ensuite incubée avec un anti - deux (généralement un anticorps marqué par une enzyme lié à un anti - un), qui est capable de renforcer le signal et de rendre la détection ultérieure plus sensible.
Détection du signal:
Enfin, le signal de liaison de l'anticorps à la protéine cible est détecté par réaction de substrat (par example chimiluminescence ou colorimétrie), typiquement à l'aide d'un système de détection par chimiluminescence.
Les systèmes automatisés peuvent automatiser l'amélioration du signal, l'exposition et la capture d'image en fonction du temps et de l'intensité définis.
Caractéristiques et avantages de l'immunoblotter de protéines entièrement automatique:
Efficacité et automatisation:
L'immunoblotter de protéine entièrement automatique peut effectuer une série d'opérations allant du chargement de l'échantillon, de l'électrophorèse en cours d'exécution, de la transmembranation, de l'incubation des anticorps aux résultats de détection, améliorant considérablement l'efficacité expérimentale et réduisant les erreurs causées par les opérations manuelles.
Contrôle précis et stabilité:
Les systèmes automatisés permettent un contrôle précis des paramètres expérimentaux tels que la température, le temps, la concentration en anticorps, etc., assurant la répétabilité et la stabilité de chaque étape.
Réduction des erreurs humaines:
L'instrumentation automatisée peut réduire l'intervention humaine dans les expériences, assurer la cohérence des opérations, en particulier dans les expériences à haut débit, améliorer la fiabilité des résultats.
Haut débit et traitement Multi - échantillons:
L'immunoblotter entièrement automatique est capable de traiter plusieurs échantillons simultanément et convient aux expériences nécessitant une analyse à haut débit, telles que le dépistage de médicaments, les tests cliniques, etc.
Intégration multifonctionnelle:
De nombreux immunoblottisseurs modernes entièrement automatisés intègrent également d'autres fonctions telles que l'électrophorèse, la transmembranation, l'incubation d'anticorps, la détection de signaux, etc., que l'utilisateur peut personnaliser en fonction de ses besoins.
Domaines d'application:
Analyse du volume d'expression des protéines:
Pour l'analyse quantitative du niveau d'expression de certaines protéines spécifiques dans les cellules ou les tissus, en particulier dans les domaines du cancer, de la recherche sur le système immunitaire, etc.
Études sur la modification des protéines:
Détecter les modifications post - traductionnelles telles que la phosphorylation, l'acétylation, la glycosylation, etc. des protéines, étudier comment ces modifications affectent la fonction des protéines.
Études pathologiques:
Dans le diagnostic de la maladie, westernblotting peut détecter des protéines spécifiques associées à la maladie, telles que la détection de marqueurs d'infections virales telles que le VIH, l'hépatite B, etc.
Développement et dépistage de médicaments:
Dans les études de médicaments, westernblotting est couramment utilisé pour évaluer l'effet d'un médicament sur l'expression de protéines spécifiques.
Recherche scientifique fondamentale:
Etudiant la régulation de l'expression des gènes, les voies de signalisation cellulaire, etc., westernblotting est un outil de recherche en biologie moléculaire.
Résumé:
L'immunoblotting entièrement automatisé de protéine automatise la technologie traditionnelle de westernblotting avec des avantages tels que l'efficacité, la précision, la fiabilité et une large gamme d'applications dans la recherche en sciences de la vie, le diagnostic médical, ainsi que dans l'industrie pharmaceutique. Grâce aux opérations automatisées, le flux et la répétabilité des expériences sont considérablement améliorés, les erreurs humaines sont réduites et une plate - forme expérimentale plus stable est fournie aux chercheurs scientifiques.