Lyseur de PolypeptidesL'utilisation opérationnelle couvre l'étalonnage et la préparation de l'équipement, le traitement des réactifs et des échantillons, l'exécution de la réaction de craquage, la purification des produits et la maintenance de l'équipement dans les cinq principaux liens,Lyseur de PolypeptidesLes étapes opérationnelles spécifiques et les précautions sont les suivantes:
I. Étalonnage et préparation de l'équipement
Vérification de l'intégrité des composants
Vérifiez que les composants tels que le cordon d'alimentation, le réacteur, la pompe, la vanne, etc. sont en bon état avant de les allumer pour vous assurer qu'ils ne sont pas cassés ou desserrés. Par exemple, si l'anneau d'étanchéité du réacteur est vieilli, il doit être remplacé immédiatement pour éviter les fuites de gaz pendant le craquage.
Vérifiez que le flacon de réservoir de solvant est bien relié au tuyau de gaz et qu'il n'y a pas de fuite. Vérifiez que la pression de l'air comprimé (air) est de 60 à 100 PSI et que la pression de l'azote (n2) est de 5 à 10 PSI.
Calibration des paramètres
Préréglage des paramètres tels que la température de craquage, la pression, le débit, etc. en fonction des besoins expérimentaux. Par exemple, la température lors de la lyse enzymatique doit être contrôlée avec précision à 37 ° C et la plage de fluctuation ne dépasse pas ± 0,5 ° c.
Les capteurs de température (semestriellement, l'erreur doit être contrôlée à ± 0,2 ℃) et les capteurs de pression (annuellement) sont régulièrement étalonnés pour assurer l'exactitude des données.
Préchauffage de l'équipement
Allumez le synthétiseur et préchauffer l'appareil à la température de réaction définie. Le temps de préchauffage varie en fonction du modèle de l'appareil et de la température, attendez patiemment.
II. Réactifs et traitement des échantillons
Préparation des réactifs
Préparer le lysat (par exemple TFA / eau / triisopropylsilane = 95: 2,5: 2,5), les réactifs d'activation (par exemple hbtu, DCC), les solvants (DMF, DCM), etc., en veillant à ce que tous les matériaux soient frais et purs et en évitant l'introduction d'impuretés.
Confirmez que le réactif ne précipite pas ou ne se détériore pas, il est recommandé de filtrer le réactif avant de l'utiliser et d'étiqueter la date d'ouverture, le réactif expiré est abandonné à temps.
Prétraitement des échantillons
Le prétraitement des échantillons de viscosité élevée ou contenant des particules par centrifugation, filtration, etc., empêche le colmatage des cavités de lyse ou l'endommagement du corps de pompe. Par exemple, un échantillon non prétraité peut entraîner une augmentation de 40% du taux d'usure du corps de pompe.
Iii. Exécution de la réaction de craquage
Fixation de résine avec acides aminés
Choisissez un support approprié en phase solide (par exemple rink amide Resin), gonflez la résine avec du Dichlorométhane (DCM), retirez les impuretés et laissez sécher.
L'acide aminé d'intérêt est mélangé avec le réactif d'activation et, après formation de l'ester actif, est envoyé dans le réacteur où il se combine avec le groupe aminé déprotégé pour former une liaison peptidique.
Réaction de lyse
Le lysat prérefroidi (tel que le mélange TFA) est ajouté et agité à température ambiante pendant 2 heures. Le processus de craquage nécessite une surveillance en temps réel de la température, de la pression et d'autres paramètres, la découverte d'une inspection d'arrêt anormale et rapide.
Après la fin du craquage, le liquide réactionnel est libéré, la résine est éliminée par essorage et lavée 3 fois avec un solvant tel que le TFA, les filtrats étant réunis.
Iv. Purification des produits
Concentration et précipitation
Le lysat est transféré dans un évaporateur rotatif à température ambiante pour être concentré dans un petit volume et le polypeptide est décanté par addition de Méthyl tert - butyl éther (MTBE).
Le précipité est recueilli par centrifugation (10 000 tr / min, 10 min), lavé 3 fois à l'éther froid et séché pour obtenir le Peptide brut.
Purification par chromatographie liquide haute performance (HPLC)
La purification est effectuée à l'aide d'une colonne en phase inverse C18, avec une phase mobile a de 0,1% TFA / eau et une phase mobile B de 0,1% TFA / acétonitrile. Dans des conditions d'élution en gradient (phase B de 10% à 60% en 0 - 30 min), on recueille les pics cibles.
Après purification par HPLC, la pureté du polypeptide peut être augmentée de 85% à 98%.
V. Entretien et entretien du matériel
Nettoyage quotidien
Après chaque utilisation, la paroi interne du réacteur est rincée à l'eau désionisée pour éliminer le lysat résiduel et les fragments de protéines. Pour les taches tenaces, il peut être brossé après trempage avec un détergent enzymatique.
La désinfection cyclique hebdomadaire des tubes avec une solution d'éthanol à 75% ou d'hypochlorite de sodium à 0,1% empêche la prolifération microbienne. Le tuyau doit être séché à l'azote après la désinfection.
Remplacement des pièces d'usure
Vérifiez l'élasticité de la bague d'étanchéité tous les 3 mois et remplacez - la immédiatement en cas de durcissement ou de fissures. Remplacez le filtre d'admission tous les 1 à 2 mois pour empêcher la poussière de pénétrer à l'intérieur de l'appareil.
Remplissez trimestriellement les pièces mobiles telles que le corps de pompe, les vannes et autres avec un lubrifiant spécial (comme la graisse à base de silicone), réduisant ainsi l'usure par friction.
Gestion du stockage à long terme
Lorsque vous n'utilisez pas l'appareil, rangez - le dans un endroit sec, aéré et protégé de la lumière, à l'abri de la lumière directe du soleil et des environnements humides. Assurez - vous que l'équipement est à l'abri des gaz et des liquides corrosifs.
Appliquez de l'huile antirouille (comme la vaseline) sur la surface métallique de l'appareil et couvrez - la d'un pare - poussière.