L'analyseur PCR quantitatif de fluorescence permet une quantification précise des gènes en surveillant en temps réel les variations du signal de fluorescence, en combinaison avec la valeur de CT et l'analyse de courbe standard, dont les principes fondamentaux et les étapes de mise en œuvre sont les suivants:

Principes fondamentaux

L'ajout d'un groupe fluorescent (tel que le colorant sybrgreen ou la sonde Taqman) au système réactionnel d'amplification par PCR permet de faire varier l'intensité du signal Fluorescent de manière synchrone avec la quantité d'amplificateur d'expansion. Pour chaque cycle PCR terminé, l'instrument recueille un signal de fluorescence qui génère une courbe d'amplification. Le nombre de cycles (valeur CT) Lorsque le produit amplifié atteint le seuil est déterminé en fixant un seuil de fluorescence (typiquement 10 fois l'écart type du signal de base). La valeur CT est négativement corrélée à la quantité de modèle de départ, c'est - à - dire que plus la quantité de modèle de départ est grande, plus la valeur CT est petite.

Étapes de mise en œuvre

Construction de courbes Standard: dilution en gradient à l'aide d'étalons de concentration connue, tels que l'ADN plasmidique purifié ou l'ARN transcriptionnel in vitro, amplification par PCR avec différentes concentrations d'étalons comme matrice. La courbe standard est tracée en abscisse avec le logarithme du nombre de copies du standard et la valeur CT en ordonnée. Lorsque la concentration de l'étalon se situe entre 10² et 10¹⁰ copies, la concentration du gabarit présente généralement une bonne relation linéaire avec la valeur de CT (coefficient de corrélation R² > 0,99), ce qui garantit une quantification précise dans cette plage.

Détection d'échantillons inconnus: amplification synchrone d'échantillons inconnus avec des étalons, calcul du nombre de copies du gène cible dans l'échantillon en fonction de sa valeur CT substituée dans la formule de courbe standard. Par exemple, si la formule de la courbe standard est y = 31372 x + 38201 (y est la valeur de CT et X est le logarithme du nombre de copies), la taille initiale du gabarit de l'échantillon peut être obtenue par calcul inverse.

Correction du ginseng interne (quantification relative): lorsqu'il est nécessaire de comparer les différences d'expression génique entre différents échantillons, les gènes de l'intendant (p. ex., GAPDH, bêta - actine) sont sélectionnés comme Ginseng interne et la quantité d'expression relative est analysée par la méthode du Δct en calculant la différence de valeur de CT (Δct) entre le gène cible et le ginseng interne, éliminant ainsi l'impact des différences de taille d'échantillon et d'efficacité de réponse.