Si le spectromètre de masse est la Banque d'empreintes digitales de Corey, la colonne HPLC est la « voie à sens unique» qui permet à des millions de suspects de passer dans la file d'attente et de vérifier l'authenticité un par un. Il ne s'agit pas d'un tube en acier inoxydable mince et long, mais d'un labyrinthe nanométrique caché à l'intérieur: des sphères de silicium de 2 µm, des pores de 100 Å, une « écorce de carbone» de C18 sont ces paysages microscopiques qui déterminent si les impuretés médicinales peuvent être capturées et si les hormones de qualité ng / ML dans le sang peuvent être « vues». Aujourd'hui, nous démontons la coquille et entrons dans cet univers "capillaire".

I. Structure: de "un tube" à "cent mille couches"

Tube 1.column: acier inoxydable 316L, diamètre extérieur 1 / 16 pouce, paroi intérieure polie miroir ra < 0,1 µm pour empêcher la propagation des courants de Foucault.

2. Remplissage: le noyau est une microsphère de silicone poreuse. Prenez par exemple les particules de noyau - coquille de 2,6 µm, noyau solide + coquille poreuse, ce qui permet de raccourcir le chemin de diffusion de 40%, le nombre de plateaux théoriques se brisant facilement par 200 000.

3. Phase stationnaire: C18 (ODS) est "gazon de carbone", chaîne octadécyle comme une rangée de contacts hydrophobes, saisir les molécules non polaires; L'analyse polaire avec hilic, puis brosser la surface de gel de silice avec une couche d'amide hydrophile, inverse "gratter l'eau".

4. Plaque de tamis: maille de filtre en alliage de titane avec un diamètre de pores de 2 µm, interceptant les résidus d'échantillon et protégeant la source d'ions de spectrométrie de masse coûteuse en aval.

Principe: un double jeu de "Course" et de "Matchmaking"

La pompe haute pression pousse la phase mobile (méthanol / eau / sel tampon) à 600 bar et les molécules de l’échantillon sont instantanément « éjectées » dans la tête de colonne. Début de la course:

• Distribution: les molécules sont "appariées" à plusieurs reprises entre la phase stationnaire et la phase mobile, les molécules hydrophiles de haute polarité sont éluées tôt et les molécules hydrophobes sont traînées par C18 dans la jambe arrière.

• Diffusion: les particules de coquille nucléaire permettent de réduire le temps de diffusion longitudinale, de rétrécir la largeur des pics et de faire monter en flèche la résolution.

• elution: le programme de gradient est comme une table d'accord, 0 - 2 min 5% B pour laver le sel, 2 - 10 min pour atteindre 95% B et "kick" la dernière impureté hydrophobe.

3. Choix: trois piliers, trois vies

• uhplc 2,1 × 100 mm, 1,8 µm: concentration sanguine clinique, 200 pics en une aiguille de 3 min, ce qui permet de gagner du temps dans la file d’attente des patients.

• 4,6 × 250 mm, 5 µm routine: méthode pharmacopée validée, robuste à dix ans sans changement de condition.

• 10 × 250 mm, 10 µm Préparation: API de 98% de pureté « sauvée» à partir de 100 mg de brut pour récupérer une épingle d'argent de colonne.

Iv. Dysfonctionnement: l'instant où "l'univers" est bloqué

La pression de la colonne est passée de 400 bar à 800 bar? La plupart du temps, c'est la précipitation de protéines dans l'échantillon qui bloque la plaque de tamis.

Facteur de traînée de crête TF > 1,5? Il est possible que les hydroxyles de silicone libres sur la surface du gel de silicone « se connectent» aux médicaments alcalins - les terminaisons ne sont pas faites.

La solution:

① filtre en ligne + 0,22 µm de filtration de l'aiguille, porter un « masque» à la colonne;

② dérive du pH? Les granulés hybrides xbridge ont été sélectionnés pour tolérer un pH de 1 à 12 afin que le développement de la méthode ne soit plus « bouclé ».

V. Evolution: course aux armements du « micron » au « submicronique »

• particules entièrement poreuses inférieures à 2 µm: LC ultra haute pression de 2 000 bar, capacité maximale > 1 000, comparable au LC bidimensionnel.

• colonne chirale: enduit d'un dérivé de cellulose, laissez une paire d'isomères miroirs « se battre entre la gauche et la droite», distinguant la différence entre la vie et la mort de moins de 0,05 min.

• colonne de puce: micro - usinage à base de silicium, graver un canal de séparation de 15 cm dans la taille d'une puce, puis améliorer l'échantillon pour compléter la Métabolomique.

Vi. Dans les coulisses: le compte de frais d'un pilier

Apparemment 3000 yuans par racine de C18, est - ce vraiment un consommable jetable?

• utilisation correcte: limite de sel, limite de pH, limite de température, durée de vie jusqu'à 3000 aiguilles;

• traitement brutal: dans le plasma à haute concentration, sans rinçage au sel, 100 aiguilles sont mises au rebut - une aiguille moyenne de 30 yuans, plus chère qu'un filament de spectrométrie de masse.

Vii. épilogue: quand les molécules traversent la nuit

À la tombée de la nuit, il ne restait plus que le faible bruit de la pompe dans le laboratoire. 0,2 µl de liquide céphalo - rachidien d'Alzheimer a été injecté dans une colonne de 2,1 mm de diamètre intérieur. Après 10 minutes, un pic inconnu a sauté sur l’écran avec un poids moléculaire de 4,2 kDa – peut - être le précurseur du prochain médicament ciblé. La colonne chromatographique est restée silencieuse, mais a écrit les indices de l'univers dans chaque tremblement de la ligne de base.

Ainsi, ce « capillaire» continue de battre, entre la phase mobile milligrade et l'échantillon nanograde, observant le regard humain sur la précision microscopique.