La colonne de chromatographie est le composant central du système d'analyse chromatographique et la façon dont elle est remplie affecte directement l'efficacité de séparation, la symétrie de pics et la durée de vie de la colonne. Un processus de remplissage raisonnable doit tenir compte des caractéristiques du remplissage, de l'uniformité du remplissage, de la stabilité du lit de colonne et des besoins d'utilisation ultérieurs. Le processus de remplissage et les points techniques de la colonne de chromatographie sont détaillés ci - dessous à partir des trois aspects du traitement avant remplissage, de la méthode de remplissage et du traitement après remplissage.

I. traitement avant remplissage

1. Sélection et traitement du remplissage

- granulométrie et distribution: la sélection de charges de granulométrie appropriée (généralement 3 - 50 µm) en fonction du mode chromatographique (par exemple HPLC, GC), une distribution étroite de granulométrie (par exemple PDI < 1,2) améliore l'uniformité de la charge.

- traitement de surface: le remplissage de la matrice de gel de silice doit ajuster le pH pour éviter l'adsorption électrostatique; Les charges C18 fortement hydrophobes doivent être préimprégnées avec du méthanol ou de l'acétonitrile pour réduire l'agglomération.

- débullition et dispersion: la suspension de remplissage doit être dégazée par ultrasons pour éviter la formation de trous dans les bulles pendant le remplissage; Les homogénats à haute viscosité permettent d'améliorer la dispersion en ajoutant des quantités appropriées d'agents tensioactifs tels que l'alcool isopropylique.

2. Pré - traitement de la colonne chromatographique

- nettoyage et séchage: les tubes de la colonne doivent être nettoyés avec des solvants tels que le méthanol, le toluène, etc. pour éliminer les débris métalliques ou les huiles, puis séchés par soufflage d'azote ou sous vide.

- traitement de surface d'extrémité: la rugosité de l'entrée et de la sortie du tube de colonne doit être inférieure à 0,1 μm pour éviter les fuites de remplissage; Un revêtement inerte tel que le Polyimide peut être appliqué pour renforcer l'étanchéité.

II. Méthode de chargement

Chargement par voie humide (Slurry Packing)

- Préparation de l'homogénat: la charge est mélangée avec un solvant (par exemple méthanol / eau, acétonitrile / eau), formulée en suspension à 5% - 30% de matière sèche, l'oscillation ultrasonore pendant 10 - 30 minutes assure une dispersion homogène.

- Remplissage de la pompe à courant constant: l'homogénat est injecté dans le tube de la colonne à l'aide d'une pompe à courant constant haute pression, le débit est généralement de 5 à 20 ml / min et la pression de la colonne est contrôlée à 60 - 120 bar. Pendant le processus de remplissage, vous devez constamment frapper les parois de la colonne, libérer les bulles d'air et favoriser l'accumulation dense de remplissage.

- décompression de gradient: réduire lentement le débit à 0,1 ml / min après la fin du remplissage, maintenir pendant 10 - 15 minutes pour stabiliser la structure du lit de colonne.

Méthode de remplissage d'homogénat (Slurry - effluent Packing)

- Chargement équilibré dynamique: pomper la suspension de remplissage dans le tube de la colonne en synchronisme avec le liquide de tête, tel qu'un solvant pur, en utilisant la différence de densité pour obtenir une décantation stratifiée. Par exemple, les charges C18 peuvent être utilisées avec du méthanol comme liquide de tête et les charges de gel de silice doivent correspondre à la polarité du solvant.

- contrôle de la température: le réchauffement à 40 - 60 ℃ peut réduire la viscosité du solvant et accélérer la décantation de la charge; Solidifier le lit de la colonne après refroidissement à température ambiante pour éviter la fissuration due à la dilatation thermique.

Chargement à sec (Dry Packing)

- scénarios applicables: principalement pour les charges de grande taille (par exemple, 50 - 200 μm) ou les charges morphologiques spéciales (par exemple, colonnes monolithiques).

- décantation par gravité: verser lentement le remplissage dans le tube de la colonne, tapoter sur la paroi de la colonne et compléter la table vibrante, de sorte que le remplissage s'accumule naturellement et densément; Pressuriser à 5 - 10 bar de durcissement après avoir placé la plaque de tamis poreux sur le dessus.

Iii. Traitement après chargement

1. Détection et correction de lit de colonne

- détection optique: Observez si le lit de la colonne est uniforme par la méthode de transmission optique ou le miroir électrique à balayage, s'il y a des fissures ou des canaux, il est nécessaire de retravailler et de recharger.

- test de débit: rincer la colonne avec un solvant pur, enregistrer la contre - pression; La pression idéale de la colonne doit être proche de la valeur théorique (par exemple, la chute de pression de la colonne HPLC ≤ 10% de la valeur théorique), une élévation anormale indique un défaut de remplissage.

2. Évaluation de l’efficacité de la colonne

- validation des standards: injection de substances à petites molécules comme le naphtalène, le benzène, calcul du nombre de plateaux (n > 10 000 / M) par rapport au facteur d'asymétrie (as < 1,5), assurance que le lit de la colonne est exempt de tranchées ou de zones mortes.

- test de stabilité à long terme: l'échantillon est alimenté en continu 100 - 200 fois, surveiller le temps de rétention et les changements de surface de crête, évaluer le degré de verrouillage du remplissage et la résistance à la pollution.

3. Stockage et conservation

- bouchage aux deux extrémités: Scellez le tube de la colonne avec un bouchon spécial pour empêcher l'entrée de contaminants; Conserver avec un solvant contenant un conservateur (p. ex., azide de sodium à 0,05%) pour un stockage prolongé.

- contrôle de l'environnement: l'abri de la lumière est conservé dans un environnement à température constante (15 - 25 ° c), la colonne de silicone doit être strictement étanche à l'humidité, la colonne inversée évite la destruction de la structure de remplissage causée par la congélation.

Iv. Points de remplissage spéciaux

1. Colonne de chromatographie chirale: le type enduit de remplissage Chiral doit être chargé sous atmosphère inerte pour éviter la désactivation oxydative; Le type de remplissage lié nécessite un pH de remplissage contrôlé pour éviter la chute du Ligand.

Colonne d'électrochromatographie capillaire: avec polymérisation in situ ou électrophorèse conduite remplissage, besoin de contrôle précis de l'intensité du champ électrique (par exemple, 50 - 200 V / cm) et la composition du tampon.

Colonne de chromatographie à ultra haute pression (uhplc): lors de l'utilisation d'une charge inférieure à 2 μm, vous devez être équipé d'un tube de colonne résistant à la pression supérieure à 1200 bar, lors du remplissage avec un fluide supercritique (par exemple, co₂) pour aider au compactage.