I. avant utilisation: bien pré - traiter, protéger la colonne de chromatographie à la source

Activation et équilibrage de la colonne: nouvelle colonne ou colonne de chromatographie inactive pendant plus d'une semaine, il est nécessaire d'équilibrer avec la phase mobile pendant 30 à 60 minutes (débit de 1,0 ml / min) avant utilisation, en veillant à ce que la phase stationnaire soit suffisamment imprégnée; La colonne de phase inverse (par exemple C18) peut d'abord rincer le volume de la colonne 20 avec du méthanol / eau (90: 10) avant de passer à la phase mobile de l'échantillon pour éviter la dégradation des performances résultant du séchage de la phase stationnaire. Si le solvant de conservation à l'intérieur de la colonne n'est pas compatible avec la phase mobile (par exemple, la colonne de phase normale est conservée avec du N - hexane, la phase mobile est du méthanol), il est nécessaire de rincer avec un gradient de solvant de transition pour empêcher l'insolubilisation du solvant de créer des bulles ou l'effondrement de la phase fixe.

Purification de l'échantillon et de la phase mobile: l'échantillon doit être filtré par une membrane filtrante de 0,22 μm pour éliminer les particules, les matières en suspension et éviter de boucher la plaque de tamis de la colonne; Les échantillons contenant des impuretés à point d'ébullition élevé, des protéines et des graisses doivent être purifiés à l'avance par extraction en phase solide (SPE) et d'autres méthodes, empêchant l'adsorption des impuretés sur la phase stationnaire. La phase mobile a besoin de dégazage ultrasonique pendant 15 - 20 minutes pour éliminer les bulles (les bulles peuvent provoquer des fluctuations de pression de colonne, des anomalies de pics); Lors de l'utilisation de la phase mobile de sel tamponné, il est nécessaire de formuler avec de l'eau de haute pureté (par exemple, de l'eau ultra - pure), après filtration, il est maintenant utilisé pour éviter que la cristallisation du sel ne bloque la colonne de chromatographie.

Vérification de l'état de l'instrument: Avant d'installer la colonne de chromatographie, nettoyer le tube de revêtement de l'entrée d'échantillon, remplacer le tampon vieillissant, éviter les débris du tampon, les résidus d'échantillon dans la colonne; Vérifiez s'il y a des fuites, des blocages dans les lignes, assurez - vous que la pression avant la colonne est stable; Confirmez que le joint de colonne est bien scellé, choisissez le tampon de graphite correspondant, évitez les fuites de gaz porteur ou la pression inégale causant des dommages à la colonne.

II. En utilisation: opération de spécification, éviter les dommages de colonne

Contrôle de la température et de la pression: respecter strictement la température maximale d'utilisation de la colonne de chromatographie (colonne inversée généralement ≤ 60 ℃, colonne positive ≤ 80 ℃), éviter la perte de phase stationnaire accélérée à haute température; La pression de la colonne doit être contrôlée dans la plage recommandée d'usine (généralement ≤ 40 MPa), si la pression augmente soudainement de plus de 30%, vous devez immédiatement arrêter la vérification (par exemple, filtrer la phase mobile, nettoyer l'entrée d'échantillon), éviter que la pression trop élevée ne provoque le compactage de la phase fixe, l'effondrement du lit de colonne. La vitesse de montée en température est recommandée ≤ 10 ℃ / min, pour éviter les chutes de température qui détruisent la structure de la colonne.

Spécification d'utilisation de la phase mobile: évitez l'utilisation de solvants corrosifs forts (tels que l'acide chlorhydrique concentré, l'hydroxyde de sodium), la gamme de pH de la phase mobile de la colonne de phase inverse doit être contrôlée à 2 - 8 (à l'exception de la colonne spéciale résistante aux acides et aux bases), au - delà de la gamme entraînera la dissolution de la matrice de gel de silice, l'hydrolyse de la phase stationnaire. Lors de l'élution du gradient, la variation de la proportion de phase organique ne doit pas être trop rapide (par example variation ≤ 10% par minute), ce qui évite une forte contraction ou expansion de la phase stationnaire; Après l'utilisation de la phase mobile contenant du sel tampon, il faut rincer à temps avec une forte proportion de phase aqueuse pour empêcher la cristallisation du sel.

Exigences de fonctionnement de l'échantillon entrant: la quantité d'échantillon entrant doit correspondre à la capacité de la colonne (quantité d'échantillon de colonne C18 conventionnelle ≤ 20 μl), éviter les surcharges entraînant une traînée de crête, une contamination de phase fixe; La température de l'entrée de l'échantillon est raisonnablement réglée, 10 - 20 ° C au - dessus du point d'ébullition maximal de l'échantillon, mais ne dépasse pas la température maximale d'utilisation de la colonne, empêchant la décomposition de l'échantillon de produire des impuretés contaminant la colonne de chromatographie. Évitez l'introduction continue d'échantillons hautement concentrés et fortement contaminés, il est recommandé de rincer 10 à 15 volumes de colonne avec une phase mobile vierge après 10 à 20 aiguilles par échantillon entrant.

Iii. Après utilisation: nettoyage à temps pour prolonger la durée de vie de la colonne

Processus de nettoyage conventionnel: après l'expérience, la colonne de chromatographie est rincée avec un gradient de phase mobile pour éliminer les échantillons résiduels et les impuretés. Colonne de phase inverse: rincer d'abord 20 volumes de colonne avec du méthanol / eau (50: 50), puis 30 volumes de colonne avec du méthanol pur ou de l'acétonitrile pour éliminer les impuretés fortement adsorbantes; Colonne en phase normale: 20 volumes de colonne sont rincés avec du N - hexane / Isopropanol (90: 10) et conservés avec du N - hexane pur. Si l'échantillon contient des impuretés difficiles à éluer telles que les protéines, les huiles et les graisses, vous pouvez ajouter 5 à 10% de tétrahydrofuranne (THF) dans le processus de nettoyage pour améliorer l'effet d'élution, mais notez la compatibilité du THF avec une partie de la phase stationnaire.

Traitement spécial de la pollution: si la pression de la colonne est élevée, le talon de crête est grave, peut être la pollution à l'intérieur de la colonne, peut être nettoyé en profondeur. Colonne en phase inverse: rinçage avec Gradient séquentiel méthanol → méthanol / THF (80: 20) → méthanol → acétonitrile, 20 volumes de colonne par pas; Colonne de phase normale: rincer avec n - hexane → n - hexane / acétate d'éthyle (50: 50) → n - hexane. Il est interdit de rincer la colonne de phase normale avec un solvant polaire fort (par exemple acétone, dichlorométhane) pour éviter la perte de phase stationnaire.

Méthode de conservation: conservation à court terme (dans un délai de 1 mois): la colonne en phase inverse est conservée hermétiquement avec du méthanol pur ou de l'acétonitrile, la colonne en phase normale est conservée avec du N - hexane, ce qui garantit l'absence de bulles d'air à l'intérieur de la colonne; Conservation à long terme (plus de 1 mois): la colonne en phase inverse est conservée avec du méthanol / eau (90: 10) et la colonne en phase normale avec du N - hexane / Isopropanol (95: 5) pour éviter le vieillissement à sec de la phase stationnaire. Lors de la conservation, les deux extrémités de la colonne de chromatographie doivent être scellées avec des bouchons, placées dans un endroit frais et sec (température 5 - 30 ℃), à l'abri de la lumière directe du soleil.

Grâce à la maintenance des spécifications ci - dessus, la durée de vie de la colonne de chromatographie liquide haute performance peut être prolongée jusqu'à 1 000 à 2 000 analyses, tout en garantissant la précision et la répétabilité des données de détection et en réduisant les coûts d'utilisation. Les méthodes de maintenance des différents types de colonnes de chromatographie (par exemple, colonnes échangeuses d'ions, colonnes chirales) doivent être ajustées en conjonction avec les instructions du fabricant, en mettant l'accent sur la compatibilité de la phase mobile et les caractéristiques de la phase stationnaire.