[Traitement de l'apparition de rubans en PCR]

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La PCR (Polymerase Chain Reaction) et l'électrophorèse sur gel sont des techniques couramment utilisées dans la recherche en biologie moléculaire et sont souvent utilisées en combinaison pour identifier et analyser les produits d'amplification par PCR. Cependant, lors de la réalisation d'électrophorèse sur gel PCR, il est fréquent de trouver dans les cartes d'électrophorèse des bandes parasites qui peuvent interférer avec les résultats expérimentaux et même conduire à l'échec de l'expérience.

Cet article explorera les causes de l'hétérophorie lors de l'électrophorèse sur gel PCR et fournira quelques solutions possibles.

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Optimisation des conditions PCR:Ajustement des conditions de la réaction PCR, une température de recuit trop basse provoque une liaison non spécifique de l'amorce au gabarit et donc une amplification non spécifique; Une température de recuit trop élevée peut inhiber la liaison normale des amorces au gabarit, ce qui affecte l'efficacité de l'amplification. La température de recuit optimale peut être déterminée pas à pas par des expériences de PCR à gradient en général, la température de l'étape de recuit de la réaction de PCR est généralement comprise entre 50°C et 68°c selon la séquence de base de l'amorce et les caractéristiques de l'ADN cible. Certaines amorces nécessitent des températures de recuit plus élevées pour assurer un collage spécifique de zones spécifiques, mais en général, la température maximale de recuit ne dépasse pas 68 ° c.

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La conception des amorces n'est pas raisonnable:Si l'amorce est trop courte en longueur, si la séquence est répétée ou si elle contient des régions à GC élevé, cela peut entraîner une liaison non spécifique de l'amorce au gabarit, qui à son tour produit des hétéro - bandes. Les amorces doivent être redessinées pour s'assurer que la longueur des amorces est appropriée, que les séquences ne sont pas répétitives, que la teneur en GC est modérée et qu'une zone de GC élevée est évitée à l'intérieur des amorces ou dans la zone de liaison des amorces au gabarit.

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Utilisation inappropriée des amorces:Des quantités d'amorces trop importantes ou peu spécifiques peuvent conduire à une amplification non spécifique, conduisant à la création d'hétéro - bandes. Il est recommandé de changer les amorces ou de réduire la quantité d'amorce utilisée.

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Le modèle n'est pas pur:L'ADN modèle contient des impuretés telles que des protéines, de l'ARN ou d'autres fragments d'ADN non ciblés qui peuvent servir de modèle pour l'amplification par PCR, entraînant l'apparition de bandes supplémentaires.

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Dégradation du modèle:L'ADN modèle se dégrade lors de l'extraction ou du stockage, et les petits fragments d'ADN qui en résultent peuvent servir de modèle pour l'amplification non spécifique.

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Purifier l'ADN modèle:L'ADN modèle dans les expériences de PCR peut provenir de nombreuses sources, y compris l'ADN génomique (adng), l'ADN complémentaire (adnc), ainsi que l'ADN plasmidique, entre autres. Cependant, les différentes sources d'ADN peuvent varier en composition et en complexité, ce qui affecte la quantité optimale de départ pour l'amplification par PCR. Par exemple, dans une réaction de PCR de 50 µl, l'ADN plasmidique ne nécessite que 0,1 à 1 ng, tandis que l'adng nécessite 5 à 50 ng. de plus, le type d'ADN polymérase utilisé a également un impact sur la quantité optimale de matrice de départ. L'ADN polymérase modifiée a une affinité plus forte pour le gabarit et une sensibilité plus élevée, de sorte que la quantité d'ADN nécessaire pour commencer est relativement faible. Il est essentiel d'optimiser la quantité initiale d'ADN, car une quantité initiale trop élevée peut entraîner un risque accru d'amplification non spécifique, tandis qu'une quantité initiale trop faible peut réduire le taux d'obtention de la PCR. Parfois, les protocoles expérimentaux de PCR utilisent le nombre de copies pour représenter la quantité initiale d'ADN, en particulier pour l'adng. Le calcul du nombre de copies implique la constante d'Avogadro et la masse molaire avec la formule spécifique: nombre de copies = l × nombre de moles = l × (masse totale / Masse molaire).

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Une concentration trop élevée de mg²⁺:Le mg² est un composant important dans la réaction de PCR, mais sa concentration trop élevée réduit la spécificité de l'amplification PCR, augmentant le risque d'amplification non spécifique. La concentration optimale en mg²⁺ doit être déterminée expérimentalement.

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Mauvaise quantité ou qualité de l'enzyme:Des quantités excessives d'enzymes ou une mauvaise qualité d'enzymes peuvent affecter la réaction de PCR. Il est recommandé de réduire la quantité d'enzyme ou de remplacer une enzyme d'une autre source.

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PCR avec démarrage à chaud:La PCR initiée à chaud peut réduire l'amplification non spécifique que la réaction peut provoquer à basse température.

La PCR à démarrage thermique est une technique utilisée pour réduire l'amplification non spécifique. Dans la PCR classique, les amorces peuvent avoir été collées sur l'ADN modèle avant que la température de réaction n'atteigne la température d'amplification. Cela peut entraîner une amplification non spécifique dès le début de la PCR, produisant des résultats hétéro - rubans ou faux positifs. La PCR à démarrage thermique résout ce problème en ajoutant une ADN polymérase Thermostable à la réaction de PCR.

La clé de la PCR à démarrage thermique est l'utilisation d'une polymérase qui nécessite une activation à haute température. Une telle Enzyme ne devient active qu'à des températures plus élevées et ne commence donc à amplifier la séquence d'ADN cible qu'au début de la réaction, sans provoquer de réaction non spécifique à basse température.

Certaines polymérases à démarrage thermique couramment utilisées comprennent une version modifiée de la Taq polymérase Thermostable, telle que la Taq DNA polymérase avec un domaine activé thermiquement, et des polymérases de haute fidélité telles que Pfu ou phusion.

Donc maintenant, les enzymes remplissent essentiellement toutes les conditions.

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Vérifiez l'environnement de laboratoire:Évitez la contamination de l'ADN et des instruments expérimentaux, utilisez des techniques aseptiques et des réactifs traités et gardez le laboratoire propre.

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PCR optimisée en gradient:La réaction de PCR a été réalisée en utilisant un gradient de température pour rechercher la température à laquelle l'amplification spécifique a été effectuée.

PCR Gradient bidimensionnel intelligent de berheng TechnologyGradient de température pour la dénaturation et le recuit optimisés simultanément dans la même réaction gradient de dénaturation transversal réglable sur 8 rangées gradient de dénaturation longitudinal réglable sur 12 colonnes température de recuit, optimisant ainsi la température de recuit optimale et améliorant ainsi la spécificité et l'efficacité de la réaction PCR.

Cette technique est utile pour optimiser les amorces, les gabarits et les conditions de PCR afin de garantir l'obtention de produits PCR de haute qualité et spécifiques.

Ces méthodes peuvent être utilisées seules ou en combinaison pour aider à réduire ou à éliminer les problèmes de ruban PCR.