Le test des protéines par les Analyseurs quantitatifs d'acides nucléiques ultra - traces (par exemple, ultra - micronucleic Acid Protein Assay) est principalement basé sur la spectrophotométrie UV - visible, qui estime la concentration d'une protéine en mesurant son Absorbance à une longueur d'onde spécifique (par exemple 280 nm). Voici les méthodes spécifiques et les étapes clés pour tester les protéines:
I. principe de test
Les résidus tryptophane (TRP), tyrosine (Tyr) ainsi que les liaisons disulfure Cys - Cys de la molécule de protéine sont absorbés de manière significative à la longueur d'onde de 280 nm. L'instrument calcule directement la concentration en protéines (mg / ML) en mesurant l'Absorbance (A280) d'une solution de protéines à 280 nm en combinaison avec la loi de Lambert - beer. Il n'est pas nécessaire de construire une courbe standard pour cette méthode, mais de s'assurer que l'échantillon ne contient pas d'autres impuretés (par exemple, acides nucléiques, substances phénoliques) qui ont une forte absorption à 280 nm.
II. Étapes opérationnelles
Préparation des instruments
Branchez l'alimentation, démarrez l'instrument et préchauffer pendant 5 - 10 minutes à l'état stable.
Sélectionnez le mode de détection "Protein A280" et réglez le trajet optique (généralement 10 mm, mais l'instrument peut s'ajuster automatiquement).
L'étalonnage du point zéro avec de l'eau distillée de haute pureté ou un tampon vierge élimine les interférences de fond.
Traitement des échantillons
Taille de l'échantillon: il est recommandé d'utiliser un échantillon de 2 μl (certains instruments prennent en charge la microdétection de 0,5 à 2 μl), en veillant à la formation d'une colonne de liquide stable.
Évitez les bulles: appuyez sur le fond du trou de détection lorsque vous effectuez un échantillon pour libérer lentement le liquide et empêcher les bulles d'affecter la mesure d'Absorbance.
Tension superficielle: si la tension superficielle de l'échantillon est faible (par exemple, avec un détergent), la quantité d'échantillon peut être augmentée à 4 μl pour garantir la stabilité de la colonne de liquide.
Contrôle vide
Prenez 2 μl d'une solution vierge (comme un tampon) et ajoutez - la à la base inférieure, déposez la base supérieure et cliquez sur le bouton « blanc» pour enregistrer l'Absorbance de fond.
Essuyez la base pour vous assurer qu'il n'y a pas de liquide résiduel.
Détection d'échantillons
Prenez 2 μl de l'échantillon à tester et ajoutez - le à la base inférieure, Abaissez la base supérieure et appuyez sur le bouton "échantillon".
L'instrument mesure automatiquement l'Absorbance et calcule la concentration, les résultats étant généralement exprimés en mg / ML.
Échantillons à forte concentration: si la valeur d'absorption lumineuse dépasse la plage de mesure de l'instrument (par exemple, intensité lumineuse < 200), il est nécessaire de procéder à une nouvelle détection après dilution de l'échantillon.
Enregistrement et nettoyage des données
Enregistrez vos résultats de détection et exportez - les au format CSV ou PDF.
Essuyez la base avec un chiffon sans poussière pour éviter la contamination croisée.
Iii. Principales considérations
Calibration de base
La longueur d'onde d'étalonnage de base par défaut est de 340 nm, que l'utilisateur peut ajuster selon ses besoins.
L'étalonnage doit être terminé avant la détection de l'échantillon, sinon les valeurs spectrales seront décalées, ce qui entraînera un mauvais calcul de la concentration.
Pureté de l'échantillon
Évitez les échantillons contenant des acides nucléiques, des Phénols ou des concentrations élevées d'ions sels susceptibles de produire une absorption interférente à 280 nm.
Pour détecter les échantillons contenant des impuretés, le fond peut être déduit en combinaison avec une méthode colorimétrique (par exemple, BCA, méthode Bradford) ou en utilisant une double longueur d'onde (280 nm / 340 nm).
Maintenance des instruments
Source lumineuse: évitez les expositions prolongées et éteignez la source lumineuse lorsqu'elle n'est pas utilisée pour une durée de vie plus longue.
Monochromateur: changez régulièrement le déshydratant (par exemple, le gel de silice) pour éviter que les éléments dispersifs ne soient moisis par l'humidité.
Détecteur: protège de la lumière forte directe ou de l'humidité de la poussière, reste propre.
Environnement: l'instrument doit être placé sur une table de travail sèche et stable, à l'écart des sorties d'air climatisées ou de la lumière directe du soleil, à une température contrôlée de 25 ℃ ± 2 ℃.
Traitement spécial des échantillons
Échantillons condensés: chargement lent avec un Chanfrein de 45 degrés pour empêcher les déversements ou les interférences Newton ring.
Substances polysaccharidiques: après la détection, vous devez rincer la voie liquide avec un réactif éthanol pour éviter les résidus.
Échantillon de graisse: si le phénomène de flottaison se produit, il doit être séparé par cryocentrifugation avant de le détecter.
Iv. Scénarios d'application et avantages
Quantification rapide: pas de pré - traitement complexe, détection complète en 2 à 5 minutes, convient au criblage à haut débit.
Microdétection: seulement 0,5 à 2 μl d'échantillon, économisez des échantillons précieux (par exemple, des échantillons cliniques, des protéines rares).
Analyse multiparamétrique: certains instruments prennent en charge la détection simultanée de a260 (acide nucléique), A280 (protéine) et od600 (concentration bactérienne) pour la quantification de plusieurs composants.
Portabilité: design compact, idéal pour les tests sur le terrain ou les laboratoires mobiles.