La colonne d'échange cationique de type mixte combine le mode de double rétention de l'échange cationique et de la chromatographie en phase inverse, son mode de fonctionnement nécessite la prise en compte des caractéristiques des deux mécanismes, les étapes spécifiques et les points clés sont les suivants:
I. préparation avant l'opération
Sélection de colonnes
Les colonnes de type mixte appropriées sont sélectionnées en fonction de la nature du composé cible (p. ex. valeur du PKA, polarité). Par exemple, une colonne de groupes sulfoniques fortement acides convient aux composés basiques du pka2 - 10 (p. ex. Amines, sulfamides).
La stabilité de la matrice de la colonne (p. ex., copolymère styrène - divinylbenzène) et des groupes fonctionnels (p. ex., groupes sulfoniques) est confirmée, ce qui garantit l'absence de décomposition dans la gamme de pH 0 - 14 et dans les solvants organiques.
Inspection de l'équipement
Vérifiez que le débit et la plage de pression du système de chromatographie (par exemple, HPLC) correspondent aux exigences de la colonne (par exemple, une pression maximale de 4500 PSI pour la colonne en acier inoxydable, 3000 PSI pour la colonne en verre).
Installez des colonnes de protection pour éviter la contamination ou le blocage des colonnes d'analyse.
Préparation des réactifs
L'éluant est formulé (par exemple, Solution Méthanolique acide, tampon acide citrique) et dégazé, filtré (membrane filtrante 0,2 - 0,5 µm) en évitant les bulles d'air et les interférences de particules.
Préparez des solvants d'activation (p. ex., méthanol, eau) et des lotions pour douches (p. ex., un mélange de solvants organiques et de sels tampons).
II. Étapes opérationnelles
Activation des colonnes
Objectif: enlever les impuretés, faire gonfler suffisamment la phase stationnaire, assurer l'effet de colonne.
Méthode:
Les colonnes sont activées successivement avec du méthanol (3 - 5 fois le volume du lit de colonne, débit 1 - 5 ml / min) et de l'eau (même volume et même débit).
Si la colonne n'est pas utilisée depuis longtemps, il faut d'abord la rincer abondamment à l'eau, puis au méthanol et enfin la conserver dans une solution aqueuse contenant 50% de méthanol.
échantillon sur échantillon
Objectif: associer la cible à la fixation, les impuretés s'écoulant avec la phase mobile.
Méthode:
La solution d'échantillon est lentement passée à travers la colonne à un débit de 0,5 - 2 ml / min, assurant un contact homogène avec la phase stationnaire.
Si la concentration de l'échantillon est trop élevée, il doit être dilué pour éviter de dépasser la capacité de charge de la colonne.
Nettoyage par douche
Objectif: éliminer les impuretés de nature différente de la cible mais adsorbées sur la colonne.
Méthode:
Choisissez un liquide de lavage (par exemple, une solution aqueuse à 5% de méthanol) contenant du solvant organique et du sel tampon en une quantité de 3 à 5 fois le volume du lit de la colonne, avec un débit de 1 à 3 ml / min.
Pour éviter l'élution de la cible, il est nécessaire d'optimiser la variété et la proportion du liquide de douche.
élution de la cible
Objectif: perturber l'interaction de la cible avec la phase stationnaire, collecter l'éluant.
Méthode:
On choisit comme éluant un mélange d'acide / base à haute concentration avec un solvant organique, tel qu'une solution méthanolique acide, à raison de 2 à 4 fois le volume du lit de colonne, avec un débit de 1 à 3 ml / min.
Recueillir l'éluant pour éviter une perte excessive de la cible par élution.
Régénération et préservation des colonnes
Objectif: restaurer l'état initial de la colonne et prolonger la durée de vie.
Méthode:
La colonne est d'abord rincée abondamment à l'eau, puis au méthanol et enfin conservée dans une solution aqueuse à 50% de méthanol, scellée et placée à une température appropriée.
Si la colonne est contaminée, elle peut être nettoyée avec des solutions spéciales telles que 1mnh₄no₃ ou isopropanol.
Iii. Principales considérations
Contrôle du débit
Évitez une chute de l'efficacité de la colonne ou une perte de phase stationnaire en raison d'un débit trop rapide, tandis qu'un débit trop lent prolonge le temps d'analyse.
Lors de l'ajustement du débit doit changer progressivement pour éviter les perturbations du lit de remplissage.
Limites de pH et de température
Évitez d'endommager les colonnes à matrice de silicone avec un pH extrême, comme les solvants alcalins avec un pH > 6,5 ou les solvants acides avec un pH < 2,5.
Il est recommandé d'utiliser la colonne à une température ambiante inférieure à 40 ℃, des températures élevées peuvent réduire la stabilité.
Sélection des éluants
Évitez d'utiliser des tampons contenant des produits de décomposition tels que l'acide salicylique afin de ne pas modifier les propriétés de la phase stationnaire.
L'éluant doit être fraîchement formulé pour éviter la contamination microbienne ou les changements de Force ionique affectant l'effet de séparation.
Prétraitement des échantillons
Filtrer l'échantillon pour éliminer les impuretés particulaires et empêcher le colmatage de la colonne.
Si la polarité de l'échantillon diffère considérablement de celle de la phase mobile, un traitement de dérivation ou de dilution est nécessaire.
Iv. Exemples de scénarios d'application
Détection de la sécurité alimentaire: lors de la détection de la mélamine (composé alcalin) dans le lait, une colonne inverse faiblement échangeuse de cations de type mixte est utilisée pour obtenir une séparation efficace grâce à un double mode d'échange de cations et de rétention de phase inverse.
Analyse pharmaceutique: l'efficacité et la sensibilité de la séparation sont améliorées en utilisant le mécanisme de double rétention de la colonne inverse d'échange cationique fort de type mixte lors de l'analyse des médicaments alcalins et de leurs métabolites dans le sang.
Surveillance de l'environnement: l'élution rapide et l'analyse quantitative des cibles sont réalisées en optimisant les conditions d'élution lors de la détection de contaminants alcalins tels que les composés aminés dans les masses d'eau.