Présentation
Le séquençage de l'ARN unicellulaire (scrna - SEQ) est une technique utilisée pour caractériser sans biais l'expression des gènes dans des échantillons complexes de cellules et de tissus. Bien que le scrna - seq Chedi ait changé la biologie moderne, il reste techniquement difficile et souvent coûteux. Les solutions actuellement disponibles sur le marché permettent une analyse efficace d'un petit nombre de cellules lorsqu'il s'agit d'un pool initial de plusieurs dizaines de milliers de cellules. Cependant, un protocole simplifié pour la préparation de banques de scrna - seq traitant des populations cellulaires rares est toujours manquant. Ici, nous avons développé une nouvelle méthode de détection de plaque de puits pour le scrna - seq rentable et hautement sensible. Ce flux de travail prend en charge la préparation de banques d'échantillons rares à partir de populations cellulaires rares. Pour ce nouveau flux de travail (Figure 1), nous avons utilisé dispencell et une tête d’aspiration de détection dédiée (SEED Biosciences, Suisse), en association avec un système de préparation de banques monocellulaires dédié et optimisé (kit BRB - seq haute sensibilité mercurius), Alithea Genomics， Suisse).
Distribution unicellulaire
Tout d'abord, nous avons testé la capacité de dispencell à distribuer des cellules uniques dans un tampon de lyse dédié avant la préparation de la Banque de séquençage. Les lignées de lymphocytes ont été décongelées à partir de flacons congelés, passées deux fois, puis récoltées dans une suspension unicellulaire. Les cellules ont été filtrées à l'aide d'un filtre cellulaire de 10 µm (miltenyi Biotec, Allemagne), comptées et diluées dans une solution de distribution de méthylcellulose sans RNase (dispenme, Seed biosciences) jusqu'à une concentration finale de 2 x 10 4 cellules / ML. Ensuite, 200 cellules ont été chargées de la suspension cellulaire à l'aide d'une tête de détection - aspiration dispencell. Dispencell est configuré pour distribuer les cellules individuelles dans des plaques 384 puits pré - chargées avec 4,2 µl de tampon de lyse (HS BRB seq Kit, alithea Genomics). Les 96 premiers trous sont répartis pendant environ 7 minutes. Ensuite, arrêtez la distribution car nous avons suffisamment d'échantillons pour l'analyse en aval.
Contrôle qualité unicellulaire
Immédiatement après la distribution, nous utilisons dispensoft, un logiciel développé par Seed Biosciences, pour le post - traitement du contrôle de qualité unicellulaire. Chaque puits de la plaque de puits est représenté par une matrice codée par couleur (figure 2.a). Lorsque les puits contiennent une seule cellule, le logiciel la marque en vert, tandis que les puits rouges contiennent zéro cellule ou plus et doivent être jetés. Pour différencier les fragments et les cellules, le seuil est fixé en Gate sur un histogramme basé sur la taille (figure 2.b). Seuls les pics supérieurs au seuil comptent comme cellules.
Ici, nous avons obtenu 77 puits unicellulaires (80% de séparation unicellulaire). Avec dispensoft, les données d'impédance brutes peuvent également être utilisées pour enregistrer le processus. Chaque courbe d'impédance peut être vérifiée manuellement. Un pic unique est caractéristique d'une seule cellule (figure 2.c), tandis que plusieurs cellules produisent plusieurs pics. Cela montre que dispencell est capable de distribuer des cellules uniques dans un tampon de lyse selon un processus simple, rapide et traçable par Wanquan.