I. Introduction au système d'expression de Pichia

Système d'expression Pichia pastoris en tant que système d'expression eucaryote très efficace, le système d'expression Pichia pastoris a un large champ d'application et des avantages significatifs. Les avantages du système d'expression de Pichia sont évidents par rapport aux autres systèmes d'expression. Il possède l'un des promoteurs actuels avec un mécanisme de régulation fort et strict, le promoteur aox1 du gène de l'alcool oxydase, qui permet une régulation plus précise et plus efficace de l'expression des gènes exogènes. Son haut niveau d'expression, qui permet à la fois l'expression intracellulaire et l'expression sécrétoire, répond grandement aux besoins de différentes études et productions. Mature et facile à amplifier, le processus de fermentation a déjà la capacité d'industrialiser la production à haute densité à grande échelle, offrant des conditions pratiques pour le développement industriel. Les coûts de culture sont faibles, les produits sont faciles à séparer, le milieu de fermentation utilisé est peu coûteux et ne contient pas de protéines, ce qui favorise la purification isolée des produits en aval et réduit les coûts de production. Le gène de la protéine exogène est génétiquement stable, intégré au Chromosome de Pichia, peut exister de manière stable avec la réplication chromosomique et n'est pas facile à perdre. En outre, en tant que système d'expression eucaryote, Pichia possède également la structure subcellulaire d'un organisme eucaryote capable d'effectuer des modifications post - traductionnelles telles que la glycosylation, l'Acylation des graisses, la phosphorylation des protéines, etc. sur les protéines exprimées, ce qui permet aux protéines exprimées de se rapprocher structurellement et fonctionnellement des protéines naturelles avec une activité biologique plus élevée.

II. Composition du système d'expression de Pichia

1, bactéries hôtes

Les bactéries hôtes de Pichia actuellement utilisées pour l'expression de protéines exogènes sont: mut + Methanol - use gs115, X - 33, smd1165, smd1163 et smd1168; Muts méthanol utilise le type lent km71; Mut - méthanol n'utilise pas le type mc100 - 3. Voir le tableau ci - dessous, énumérant en détail les différentes bactéries hôtes d'expression et les caractéristiques d'expression de Pichia

Tableau 1 bactéries hôtes communes exprimées par Pichia et caractéristiques

La souche	caractéristique
GS115	Avec un niveau d'expression élevé, une densité cellulaire élevée, un rendement élevé en protéines solubles, actuellement utilisé par une large gamme de bactéries hôtes
le KM71	Utilisation du méthanol type lent, adapté à l'expression de protéines difficiles à dissoudre
X33	Peut augmenter le volume d'expression et l'activité, adapté à l'expression de protéines recombinantes
SMD1168H	Meilleure efficacité d'expression et densité cellulaire plus élevée pour l'expression de protéines macromoléculaires
SMD116 (his4 pep4)	Appartenant à une souche de type protéase délétée, elle est capable de réduire la dégradation des protéines et de résoudre le problème de la distribution inégale des produits d'expression due à la dégradation des protéines, bien que la croissance de la souche soit relativement lente, ce qui peut entraîner une faible production de protéines exogènes exprimées.
Le Y-11430	Expressivité efficace et expression réglable

2, le porteur

Les vecteurs d'expression de Pichia sont dominés par des vecteurs de type intégratif, les vecteurs communs pouvant être divisés en vecteurs d'expression intracellulaire et en vecteurs d'expression sécrétoire.

Tableau 2 transporteurs d'expression communs de Pichia et caractéristiques

Iii. Processus de fermentation de la levure Pichia

1, phase de fermentation de Pichia

La fermentation de Pichia est généralement en deux étapes: 1, phase de croissance cellulaire: d'abord dans le milieu de culture où la source de carbone est le glycérol ou le glucose, accumule une densité cellulaire et une biomasse suffisantes, lorsque la concentration de la bactérie atteint un certain stade, lorsque le glycérol ou le glucose est épuisé, il provoque une augmentation soudaine de la valeur de l'oxygène dissous à environ 100%, puis commence à couler avec la solution de glycérol ou de glucose et maintient le volume de ventilation et la vitesse d'agitation pour maintenir le niveau d'oxygène dissous à environ 30%, augmentant encore la biomasse (mycorhium). 2, phase d'induction: lorsque la biomasse a atteint les exigences, arrêter la source de carbone de supplémentation, la source de carbone est épuisée, après la fin de la période de transition, la source de carbone est commutée au méthanol pour induire l'expression de la protéine d'intérêt dans la phase de fermentation. L'addition intermittente générale de 0,3% de méthanol est induite deux fois, puis le début de l'induction de la protéine d'expression par le méthanol d'écoulement permet d'augmenter le niveau d'expression de la protéine exogène et permet à Pichia d'accumuler des concentrations élevées de la protéine cible en moins de temps.

La phase d'expression induite est un maillon clé du processus de production fermentaire de Pichia, au cours de laquelle le méthanol est utilisé comme inducteur spécifique, remplaçant la source de carbone précédente. Les gènes de l'alcool oxydase (tels que aox1) chez Pichia sont activés en présence de méthanol, ce qui entraîne une expression très efficace des gènes exogènes. Le contrôle des conditions à ce stade a des implications importantes pour le rendement et la qualité des protéines exogènes et nécessite un contrôle strict des paramètres tels que la quantité de méthanol ajoutée, le taux d'addition et la température, le pH et la quantité d'oxygène dissous dans l'environnement de fermentation, afin de garantir que les gènes exogènes peuvent être exprimés de manière durable et efficace tout en évitant la toxicité du méthanol sur les cellules, ainsi que d'autres effets néfastes.

2, types et formulations de milieu de fermentation

Il existe une grande variété de milieux de fermentation de Pichia, et différentes formulations de milieux de fermentation sont adaptées à différents stades et objectifs de fermentation.

Le milieu bsm (Basic Salt) est l'un des milieux de base couramment utilisés pour la fermentation de Pichia et sa formulation typique est: acide phosphorique à 85% 26,7 ml / L, sulfate de calcium dihydraté 0,93 G / L, sulfate de potassium 18,2 G / L, sulfate de magnésium heptahydraté 14,9 G / L, hydroxyde de potassium 4,13 G / L, glycérol 40,0 G / L, ptm1 4,35 ml / L. Ce milieu est capable de fournir des nutriments essentiels pour la croissance de Pichia, y compris des sels inorganiques tels que des sources d'azote, de phosphore, de potassium, de magnésium et de glycérol comme source de carbone, tandis que le ptm1 est complété par des éléments nutritifs tels que des oligo - éléments et des vitamines nécessaires à La croissance de la levure, contribuant au maintien de la croissance normale et du métabolisme des cellules de levure.

Le milieu F22 est également un milieu de fermentation de Pichia commun dont la formulation peut être adaptée à différentes applications de recherche et de production, mais contient généralement des quantités appropriées de sources de carbone (par exemple, Glucose ou glycérol), d'azote (par exemple, extrait de levure, Peptone, etc.), de sels inorganiques (par exemple, sulfate de magnésium, chlorure de calcium, Dihydrogénophosphate de potassium, etc.) et d'autres additifs (par exemple, biotine, solutions d'oligo - éléments, etc.). Par rapport aux milieux bsm, les milieux F22 peuvent être optimisés en composition et en proportion de nutriments pour répondre à des besoins spécifiques de fermentation, par exemple, ils peuvent être plus favorables à l'augmentation de la quantité d'expression de protéines exogènes ou à l'amélioration de la qualité des protéines dans certains cas.

En plus des deux milieux communs mentionnés ci - dessus, il existe de nombreux autres milieux de fermentation de Pichia, dont les formulations ont tendance à être optimisées et adaptées aux objectifs expérimentaux spécifiques, aux caractéristiques des souches et aux exigences du procédé de fermentation. Par example, dans certaines études, afin d'améliorer l'efficacité d'utilisation de Pichia vis - à - vis d'un substrat particulier ou d'améliorer sa tolérance au stress environnemental, des ingrédients spécifiques tels que des acides aminés, des acides organiques, des polysaccharides, etc., sont ajoutés au milieu de culture; Soit d'optimiser la croissance et les voies métaboliques des cellules de levure en ajustant les proportions de source de carbone, de source d'azote et de sel inorganique dans le milieu de culture, ce qui permet une efficacité de fermentation et un rendement en produits plus élevés.

3, paramètres du processus de fermentation

Au cours de la fermentation de Pichia, le contrôle précis des paramètres du processus joue un rôle essentiel dans le succès ou non de la fermentation, tels que le pH, la température, l'oxygène soluble, etc., qui sont liés, interagissent et déterminent ensemble l'état de croissance de Pichia, l'activité métabolique et le niveau d'expression des protéines exogènes.

PH: est l'un des facteurs clés qui influencent la fermentation de Pichia. Pichia a des exigences de pH différentes à différents stades de croissance et au cours du métabolisme. Dans la phase de croissance cellulaire, le pH généralement approprié varie de 5,0 à 6,0, dans ces conditions de pH, les cellules de levure peuvent maintenir un bon état de croissance, l'activité enzymatique peut également être mieux utilisée, favorisant la prolifération cellulaire et l'accumulation de métabolites. Le pH, au cours de la fermentation de Pichia Pichia, affecte non seulement l'état de croissance des bactéries, mais a également un impact important sur l'expression des protéines exogènes. L'effet du pH sur Pichia comprend principalement les aspects suivants: (1) influence l'activité des enzymes intracellulaires, qui à leur tour affectent le métabolisme des cellules, de sorte que l'expression des protéines exogènes est également affectée; (2) affecte la perméabilité des membranes cellulaires, exerce un certain effet sur les cellules lorsqu'elles absorbent les nutriments et excrètent les produits métaboliques; (3) le pH peut avoir un effet sur la dissociation des composants et des métabolites des cellules dans le milieu de culture et donc sur l'absorption des nutriments par les cellules; (4) le pH peut également avoir un impact sur le processus métabolique des cellules, de sorte que le contenu des métabolites cellulaires est modifié en outre, dans le processus de fermentation à haute densité, afin de réduire la dégradation des protéines exogènes par la protéase, il faut éviter l'action de la protéase au pH optimal, régler Le pH à un point électrique différent de la protéine exogène et d'autres, également améliorer le taux de récolte des protéines exogènes.

Température: a également un effet significatif sur la croissance et le métabolisme de Pichia. La température de croissance de Pichia est généralement plus appropriée entre 28 et 30 ° c. Dans cette gamme de température, les cellules de levure se développent rapidement, ont une activité métabolique vigoureuse et sont capables d'utiliser efficacement les nutriments du milieu de culture pour la croissance et la reproduction. Cependant, si la température est trop élevée, au - delà de 32 ° C, elle peut entraîner la mort cellulaire, car la chaleur peut perturber la structure membranaire de la cellule, la stabilité des macromolécules biologiques telles que les protéines et les acides nucléiques, ce qui affecte le fonctionnement physiologique normal de la cellule. Inversement, à des températures plus basses, alors que la croissance des cellules ralentit, certaines études suggèrent qu'une réduction appropriée de la température de culture peut améliorer la production et la qualité de la protéine cible. En effet, les basses températures peuvent réduire le stress lié au repliement des protéines intracellulaires et réduire l'apparition de faux repliements, tout en réduisant l'activité des protéases et en diminuant le degré d'hydrolyse des protéines exogènes, favorisant ainsi le repliement et l'accumulation corrects des protéines exogènes.

Oxygène dissous (do): est un autre paramètre clé du processus de fermentation de Pichia. Pichia a besoin de l'implication de l'oxygène à la fois pour la croissance et le métabolisme en utilisant la glycérine et le méthanol, de sorte que le maintien d'un niveau approprié d'oxygène dissous est essentiel pour assurer le bon déroulement de la fermentation. Il est généralement nécessaire de maintenir la concentration en oxygène dissous à un niveau & gt; 20% tout au long de la fermentation. Au début de la croissance cellulaire, le besoin en oxygène est relativement faible en raison du faible nombre de bactéries, auquel cas les besoins en oxygène des cellules peuvent être satisfaits par une ventilation et une agitation appropriées. La consommation d'oxygène augmente progressivement au fur et à mesure que la croissance cellulaire et l'activité métabolique augmentent, ce qui nécessite un ajustement supplémentaire de la ventilation, de la vitesse d'agitation ou de l'utilisation de suppléments d'oxygène pur pour augmenter les niveaux d'oxygène dissous afin de garantir que les cellules peuvent obtenir suffisamment d'oxygène pour le métabolisme. Si l'oxygène n'est pas suffisamment dissous, il peut entraîner une croissance cellulaire lente, une diminution de l'accumulation de produits métaboliques et même la mort cellulaire, ce qui peut sérieusement affecter l'efficacité de la fermentation et la production de produits.

Temps de culture: est l'un des facteurs les plus critiques pour obtenir le niveau d'expression protéique le plus élevé dans le système d'expression de Pichia, où le temps de production est relativement long (environ 100 h). Le temps de culture est lié au nombre de cellules de levure et au degré de dégradation de la protéine cible, il existe des études montrant que la densité de croissance la plus élevée des cellules de Pichia Pasteur est de 96h en culture, tandis que l'expression de la protéine la plus élevée se produit à 48h [11], ce qui suggère qu'un temps de culture plus long entraînera probablement une digestion hydrolytique de la protéine exprimée, il existe également d'autres études montrant que le temps d'expression optimal de la protéine se produit en culture de 72 à 96h [2].

Le processus de fermentation de Pichia est un processus complexe et délicat qui nécessite un contrôle et une optimisation précis des étapes de fermentation, de la formulation du milieu de culture et des paramètres du processus, qui peuvent être systématiquement optimisés pour les conditions de fermentation telles que le pH, la température, l'oxygène dissous et la composition du milieu de culture pour tirer pleinement parti des avantages de Pichia, permettant une expression et une production efficaces de protéines exogènes grâce à la méthode de conception expérimentale (DOE). Grâce à une compréhension approfondie des caractéristiques de fermentation et des besoins de Pichia, combinée à des technologies et des équipements de fermentation avancés, l'optimisation continue du processus de fermentation promet d'améliorer encore l'efficacité et la qualité du produit de la fermentation de Pichia.

Iv. La « Coopération tacite» de la levure Pichia avec le fermenteur

Dans le processus de fermentation de Pichia Saccharomyces, le fermenteur, en tant qu'équipement de base, fournit des conditions environnementales critiques pour la croissance et le métabolisme de Pichia Saccharomyces, assurant qu'il peut exprimer efficacement des protéines exogènes.

Le fermenteur fournit une température de croissance appropriée pour Pichia grâce à un système de contrôle de température précis. Comme indiqué précédemment, les exigences spécifiques de température de Pichia pendant la phase de croissance à 28 - 30 ° C et pendant la phase d'expression induite, le système de contrôle de la température du fermenteur est capable de maintenir avec précision dans ces plages de température de consigne, en évitant les effets néfastes d'une température trop élevée ou trop basse sur la croissance des cellules de levure et l'expression des protéines. Ce contrôle précis de la température est particulièrement important dans la production de fermentation à grande échelle, ce qui garantit que chaque lot de Pichia peut croître dans un environnement de température stable et appropriée, améliorant ainsi la stabilité et la répétabilité de la production.

Pour la régulation du pH, les fermenteurs sont équipés de dispositifs avancés de détection et de régulation du pH. Au cours des différentes étapes de la fermentation de Pichia, en fonction de la variation de sa demande de pH, le fermenteur est capable d'ajouter automatiquement une solution acide - base, en maintenant le pH exactement dans la plage souhaitée. En maintenant un pH de 5,0 - 6,0 pendant la phase de croissance cellulaire et en induisant un ajustement de la phase d'expression à 3,0 - 5,0, ce contrôle précis du pH aide à maintenir l'activité des enzymes intracellulaires de la levure et favorise la croissance et le métabolisme normaux des cellules, tout en réduisant la dégradation des protéines exogènes et en améliorant la production et la qualité des protéines.

Le contrôle du niveau d'oxygène dissous est également l'une des fonctions clés du fermenteur. Pichia a une forte demande en oxygène soluble pendant la fermentation et le fermenteur, grâce à un système d'aération raisonnable et à un dispositif d'agitation, garantit que la concentration en oxygène soluble est maintenue à un niveau & gt; 20% en tout temps. Le système d'aération est capable d'introduire uniformément de l'air ou de l'oxygène dans le liquide de fermentation, tandis que le dispositif d'agitation, par agitation constante, permet à l'oxygène d'être suffisamment dispersé dans le liquide de fermentation, améliore l'efficacité du transfert de l'oxygène, répond aux besoins en oxygène de Pichia Saccharomyces à différents stades de croissance, garantit le bon déroulement de son activité métabolique et favorise à son tour l'expression efficace des protéines exogènes.

La synergie des systèmes d'agitation et d'aération garantit également une distribution uniforme des nutriments dans le ferment, évitant ainsi l'apparition de carences ou d'excès nutritionnels localisés, permettant à chaque cellule de Pichia de croître dans un bon environnement nutritionnel. Dans le même temps, la performance d'étanchéité du fermenteur est également très importante, elle peut empêcher la contamination par des bactéries étrangères, assurer la pureté et la stabilité du processus de fermentation de Pichia, éviter des problèmes tels que l'échec de la fermentation ou la qualité réduite du produit en raison de la contamination bactérienne.

Les produits de fermentation de Jinwei sont conçus et fabriqués sur la base de ces besoins clés, avec un contrôle avancé de la température, une régulation du pH, un contrôle de l'oxygène et un système d'agitation et d'aération très efficace, capables de fournir des conditions environnementales optimisées pour la fermentation de Pichia Saccharomyces, aidant les utilisateurs à atteindre une production de fermentation de Pichia Saccharomyces efficace et stable, que ce soit dans la phase d'essai en laboratoire ou dans la production industrielle à grande échelle, les performances peuvent être exécutées, répondre aux diverses exigences de fermentation de Pichia Saccharomyces de différents utilisateurs et contribuer au développement florissant de l'industrie de la biotechnologie. Nous continuerons à prêter attention à la dynamique de recherche et aux besoins d'application de Pichia Saccharomyces, à optimiser et à innover en permanence la conception et la technologie de fabrication des fermenteurs, à améliorer les performances et la stabilité des fermenteurs, à fournir un support d'équipement plus avancé et plus efficace pour la production de fermentation de Pichia Saccharomyces et à promouvoir conjointement l'industrie de la biotechnologie vers un avenir plus brillant.

Introduction au fermenteur Jinwei
Jimway-be ® Série Lab --------------- réacteur de niveau de table

Jimway-be ® Série PM ---------- Bioréacteur multiplex

Occasions applicables: culture et fermentation et expression des cellules procaryotes / Eucaryotes

Volume de la boîte de pétri: 250ml / 500ml / 1L / 3L / 5L / 10l

Nombre d'unités: 2 - 16 connexions

Mode de culture: suspendu & mural

Type de pagaie: Triple, hexagonale, six feuilles Plates, semi - tubulaire, pale de levage et autres combinaisons multiples

Mode de transmission: entraînement par couplage magnétique / agitation mécanique

Stratégie de contrôle: PID et stratégie de contrôle par paliers (recharge, vitesse d'agitation, température, ventilation, etc.)

Contrôle de remplissage: contrôle de remplissage précis (erreur ± 1g)

Caractéristiques fonctionnelles:

Interface concise: quelques minutes pour maîtriser l'opération, double

Sans surveillance: peut accéder à distance, opérer, réaliser sans surveillance

Fonction de formule: formule un clic vers le bas pour réduire les erreurs de fonctionnement du personnel et améliorer la qualité

Analyse de données: permet la comparaison de données multi - lots, peut également être complété par Doe & Pat pour l'analyse multivariée en profondeur, optimise les données de processus

Partage de données: lancement de web basé sur un VPN qui permet la surveillance et la visualisation de la courbe historique du côté mobile (Android, IOS, Windows) Tout en garantissant la sécurité des données et des appareils