Dans le système de détection de l'analyseur d'acides aminés, la dérivation post - colonne est une étape clé dans la conversion des acides aminés séparés par colonne chromatographique en dérivés détectables avec une grande sensibilité, tandis que la détection par fluorescence est un moyen central de réaliser une analyse quantitative des acides aminés en capturant le signal de fluorescence du dérivé. La combinaison des deux peut résoudre le problème des « acides aminés libres eux - mêmes avec un signal de fluorescence faible et difficile à détecter directement et avec une sensibilité élevée», est la combinaison technologique dominante de l'analyse moderne des acides aminés (en particulier l'analyse des traces), dont le principe peut être démonté en deux parties, « mécanisme de réaction dérivé post - colonne» et « principe optique de détection de fluorescence», comme suit:
I. principe de la dérivation post - colonne: transformation des "acides aminés difficiles à détecter" en "dérivés faciles à détecter"
Les molécules d'acides aminés (à l'exception du tryptophane) sont elles - mêmes dépourvues de groupes d'absorption UV ou d'émission de fluorescence puissants et leur sensibilité est extrêmement faible lorsqu'elles sont détectées directement (les besoins en analyse de traces de l'ordre du μg / l ne peuvent être satisfaits). La logique de base de la dérivation post - colonne est la suivante: laisser les acides aminés séparés par une colonne de chromatographie échangeuse d'ions (un mode de séparation couramment utilisé pour l'analyse des acides aminés) Réagir chimiquement avec un « réactif dérivé» spécifique après l'écoulement de la colonne pour produire des dérivés stables avec une forte fluorescence (ou une forte absorption UV), créant ainsi les conditions d'une détection ultérieure hautement sensible.
1. Processus de base: séparation → mélange → réaction → détection
Le système de dérivation post - colonne se compose d'un "réservoir de stockage de réactifs dérivés, d'un mélangeur, d'une bobine de réaction, d'un dispositif de régulation de la température" avec les étapes spécifiques suivantes:
Séparation des acides aminés: plusieurs acides aminés de l'échantillon sont séparés par une colonne échangeuse d'ions (par exemple, une résine échangeuse de cations sulfonique) qui s'écoule de la colonne dans un ordre particulier en raison des différences d'affinité des différents acides aminés avec la résine;
Mélange des réactifs: le flux d'acides aminés (phase mobile + acides aminés) après séparation est bien mélangé avec le flux de réactifs dérivés tels que l'indanetrione, le phtalaldéhyde OPA, le Chloroformiate de fluorène - 9 fmoc au moyen d'un "mélangeur en t";
Réaction thermostatique: le mélange entre dans une « bobine de réaction à température contrôlée» (généralement de 30 à 130 ° C, selon le réactif) et une réaction dérivée se produit à une température spécifique pour produire un dérivé fluorescent;
Détection d'entrée: le dérivé après réaction s'écoule directement dans le détecteur de fluorescence pour la capture du signal.
II. Principe de détection de fluorescence: capter le signal de fluorescence du dérivé, réaliser une analyse quantitative
La détection de fluorescence est basée sur le phénomène de « Photoluminescence »: lorsqu'un dérivé Fluorescent est éclairé par une longueur d'onde spécifique de lumière (excitation), l'énergie absorbée par les électrons dans la molécule passe à un niveau énergétique élevé, puis libère une partie de cette énergie par une transition non radiative, qui retourne à L'état fondamental et émet une longueur d'onde spécifique de lumière (fluorescence). Le détecteur de fluorescence Convertit l'intensité de la fluorescence en un signal électrique par "filtration de la lumière d'excitation, collecte de fluorescence, conversion de signal", permettant finalement l'analyse quantitative des acides aminés.
1. Structure de base et flux de travail du détecteur de fluorescence
Le détecteur de fluorescence est principalement constitué d'une "source lumineuse, d'un monochromateur d'excitation, d'une cellule d'échantillon, d'un monochromateur d'émission, d'un photomultiplicateur (PMT), d'un processeur de signal", les étapes spécifiques étant les suivantes:
Production de lumière d'excitation: lumière Composite émise par une source lumineuse (lampe au xénon couramment utilisée, qui peut fournir un spectre continu de 200 à 800 nm), filtrée par un "monochromateur d'excitation" (composé d'un réseau et d'une fente), ne conservant que la lumière monochromatique adaptée à la "longueur d'onde d'excitation" du dérivé (par exemple, un dérivé OPA correspond à une excitation de 340 nm);
Excitation et émission de fluorescence: la lumière d'excitation traverse la cellule d'échantillon (elle traverse la solution de dérivé après dérivation post - colonne) et la molécule de dérivé émet de la fluorescence après absorption d'énergie (la direction de fluorescence est perpendiculaire à la lumière d'excitation pour éviter les interférences de la lumière d'excitation);
Filtration et collecte de la fluorescence: la fluorescence émise est filtrée par un "monochromateur émetteur" (élimination de la lumière parasite et de la luminescence d'excitation non absorbée), ne conservant que la lumière monochromatique adaptée à la "longueur d'onde d'émission" du dérivé (par example 450 nm de lumière émise pour un dérivé OPA);
Conversion et quantification du signal: la fluorescence filtrée est reçue par un "photomultiplicateur (PMT)", qui convertit le signal lumineux faible en un signal électrique proportionnel (courant ou tension) qui, après amplification par un processeur de signal, conversion analogique - numérique, génère un chromatogramme "intensité de fluorescence - temps de rétention";
Base quantitative: selon la « forme étendue fluorescente de la loi de Lambert - beer» - dans une certaine plage de concentration, l'intensité de fluorescence du dérivé Fluorescent est proportionnelle à la concentration en acides aminés, en comparant « l'intensité de fluorescence du dérivé d'acide aminé standard (courbe standard) » avec « l'intensité de fluorescence du dérivé de l'échantillon», vous pouvez calculer la concentration de chaque acide aminé dans l'échantillon.
2. Avantages de base de la détection de fluorescence: haute sensibilité et haute spécificité
Par rapport à la détection par absorption UV, la détection par fluorescence présente des avantages irremplaçables dans l'analyse des acides aminés, ce qui est la raison principale pour laquelle la dérivation post - colonne est souvent associée à la détection par fluorescence:
Haute sensibilité: la limite de détection (LOD) de la détection par fluorescence peut atteindre l'ordre de nmol / l ou même PMOL / L (de 1 à 3 ordres de grandeur en dessous de la détection UV), capable de détecter des traces d'acides aminés (telles que des élévations d'acides aminés traces dues à des anomalies métaboliques) dans des échantillons biologiques (tels que le sang, l'urine);
Haute spécificité: seuls les « dérivés capables de produire de la fluorescence» peuvent être détectés, tandis que la phase mobile, les impuretés (si elles ne réagissent pas avec le réactif dérivé) n'ont pratiquement aucun signal de fluorescence, ce qui peut efficacement éviter les interférences hétéroclites (telles que l'analyse des acides aminés après l'hydrolyse des protéines dans les aliments, sans traitement préalable complexe pour l'élimination);
Large plage de linéarité: l'intensité de fluorescence présente une bonne relation linéaire avec la concentration en acides aminés dans une plage de concentration de 10⁴ - 10⁵, adaptée à la quantification d'échantillons de différentes teneurs (de traces à constantes).
Iii. Logique synergique de la dérivation post - colonne avec détection de fluorescence (pourquoi faut - il combiner?)
La combinaison des deux résout parfaitement le point douloureux « séparation - détection» de la détection des acides aminés, formant une boucle fermée:
Dérivation post - séparation pour éviter les interférences: la dérivation post - colonne est réalisée après séparation des acides aminés par la colonne chromatographique, le réactif dérivé ne réagit pas avec les impuretés de l'échantillon telles que les protéines, les sels (les impuretés ont été séparées par la colonne chromatographique ou ne possèdent pas de groupe amino), En évitant les "impuretés dérivées affectant la séparation" (la dérivation pré - colonne peut entraîner un chevauchement des pics en raison de la co - élution du produit dérivé avec les impuretés);
Fluorescence post - dérivée, amélioration de la sensibilité: en transformant les « acides aminés non fluorescents» en « dérivés fluorescents puissants» par dérivation, la détection de fluorescence peut capturer un signal faible et répondre aux besoins d'analyse des traces (par exemple, détection précise du profil métabolique des acides aminés dans le diagnostic clinique);
Le signal est lié à la concentration pour atteindre la quantification: l'intensité de fluorescence est directement proportionnelle à la concentration du dérivé (c'est - à - dire la concentration en proto - acides aminés) et, en combinaison avec la courbe standard, la teneur en chaque acide aminé peut être quantifiée avec précision, ce qui donne une bonne répétabilité (RSD généralement < 2%).