À propos de la caractérisation de EV
L'estimation de la quantité d'ev, la détermination de la présence d'ev et l'évaluation de la part et de l'impact des composants non EV dans la préparation d'ev, entre autres, nécessitent une caractérisation de EV. La caractérisation de l'EV est confrontée à des défis tels que la petite taille des particules, l'hétérogénéité dimensionnelle et moléculaire, l'absence de méthodes universelles de reconnaissance de l'ev et la spécificité non EV de nombreuses techniques de mesure.Aucune mesure ou méthode ne peut répondre aux exigences de toutes les caractérisations ev, il est donc recommandé de vérifier les unes les autres en utilisant une méthode orthogonale (c. - à - D. une méthode sans les mêmes limites de mesure).C'est - à - dire que les paramètres de caractérisation d'EV en tant qu'attribut de qualité critique (CQA) recommandent des méthodes utilisant deux ou plusieurs principes différents pour détecter le même indicateur.
La composition globale de l'EV (teneur et proportion de protéines, lipides, acides nucléiques et autres biomolécules, etc.) varie selon la source de l'EV. Bien que les mesures de ces classes moléculaires individuelles puissent être utilisées pour estimer l'abondance ev, ces valeurs ne sont pas nécessairement toutes corrélées à la concentration ev et il n'y a pas non plus de prévalence entre les matériaux sources; Par conséquent,Ils ne doivent pas être utilisés comme mesure de la concentration EV.Tout comme il n'y a pas de détection d'une seule molécule qui puisse quantifier tous les ev, il n'y a pas de marqueur moléculaire universel pour les EV ou les isoformes EV. Les marques spécifiques doivent être sélectionnées en fonction des preuves de spécificité de source et de spécificité de type. Actuellement,Il n'existe pas de marqueur universel connu permettant d'identifier tous les ve, quelle que soit leur origine.Pour les soi - disant exosomes, la prévalence de ces marqueurs n'est pas connue ou acceptée. Notez que les protocoles basés sur l'affinité impliquant les protéines transmembranaires quadruples cd9, cd63 et cd81 ne sont pas spécifiques des exosomes qui sont des isoformes EV; L'utilisation d'une population EV enrichie en anticorps contre l'une de ces protéines transmembranaires quaternaires ne couvre pas l'ensemble de la composition moléculaire. De plus, tous les EV n'expriment pas ces marqueurs protéiques, de sorte que quatre enrichissements de protéines transmembranaires ne capturent pas tous les EV.Méthode orthogonale de détection d'un même paramètre de caractérisation(méthode de plus d'un principe)Il est peu probable d'avoir le même écart; Par example, le diamètre de EV est déduit et détecté simultanément respectivement par des méthodes optiques et non optiques.La caractérisation des échantillons EV à l'aide de méthodes orthogonales est également essentielle pour démontrer que les co - isolats ne sont pas associés à des biomarqueurs ou à des découvertes fonctionnelles.Étant donné que de nombreuses méthodes de caractérisation des ve ne sont pas spécifiquement adaptées aux ve ou qu'elles ne peuvent pas toutes être détectées, les méthodes et les résultats doivent être publiés de manière transparente pour assurer la répétabilité des données sur les ve.
I. quantification de la concentration de particules
Ensemble, les mesures quantitatives et volumétriques de l'EV définissent les concentrations numériques (en parties / ML), un indicateur largement rapporté et utilisé. Cependant, il n'est généralement pas fiable, car de nombreuses technologies manquent de spécificité vis - à - vis des ve et de sensibilité à tous les ve.Le Groupe de travail isev sur les matériaux de référence EV rigoureux et normalisés a récemment décrit les considérations relatives aux techniques de mesure et les défis auxquels le domaine est confronté pour faire face aux matériaux de référence EV qui peuvent être mesurés de manière traçable, développés et bien caractérisés. Un point culminant clé de ce travail est la nécessité de publier la Lod de la méthode de détection, permettant ainsi aux autres de valider les résultats indépendamment des limites de sensibilité.La crédibilité de la mesure de la concentration EV peut être améliorée en utilisant la méthode orthogonale，Chaque méthode a une Lod déterminée, par exemple pour détecter l'intensité de diffusion de la lumière(comme NTA), intensité de fluorescence(comme la FCM)Et taille physique(comme RPS),Parce que la méthode orthogonale n'a pas les mêmes limites de mesurePar exemple, la technologie d'induction par impulsions résistives (RPS) peut représenter la Lod en termes de taille des particules. Pour les techniques optiques telles que la cytométrie en flux, la Lod peut être rapportée avec un diamètre dérivé d'un modèle optique de diffusion de la lumière ou avec une molécule de Fluorophore soluble équivalent (mesf) dérivée de l'intensité de fluorescence. Ces méthodes peuvent produire des données cohérentes entre différents instruments et sensibilités. Comme la détection de particules implique plus de variables, doncIl n'y a actuellement aucune méthode pour Nanoparticle Tracking Analysis (NTA), Dynamic Light Scattering (DLS)) etOu la cytométrie de flux d'imagerie conduit à Lod traçable- Oui.Pour les techniques qui ne permettent pas de distinguer les ve d'autres co - isolats ou contaminants potentiels, il est recommandé d'exprimer le rapport de concentration sous la forme « concentration de particules ou concentration de PE » plutôt que « concentration de ve », quelle que soit l'étape de séparation en amont.
II. Quantification de la taille des particules
La mesure de la taille EV (en Nano - rayon ou diamètre) repose sur des hypothèses telles que la sphéricité ou la mobilité, et les résultats de sortie peuvent être influencés par des variables en amont. Méthodes courantes à haut débit, y compris la cytométrie de flux, NTA、RPS、 La diffusion de la lumière Multi - angle et la diffusion dynamique de la lumière (DLS) supposent toutes deux que EV est sphérique. Bien que les termes « taille» et « diamètre» soient souvent utilisés de manière interdépendante entre les méthodes de mesure, la façon dont ils sont déduits peut également entraîner des différences cohérentes entre les techniques de mesure. Par exemple,Les techniques qui dépendent du mouvement brownien des particules, telles que NTA ou DLS, mesurent le diamètre hydrodynamique et conduisent à une estimation trop élevée de la taille des particules par rapport aux méthodes d'imagerie telles que les miroirs cryoélectriques.Et peu de méthodes permettent de mesurer avec précision la taille de l'EV sur toute la gamme de diamètres possibles de l'ev, de quelques dizaines de nanomètres à microns. Par exemple, alors que l'imagerie à haute résolution d'un cryoscope est l'une des méthodes les plus précises, son flux de détection est relativement faible et de nombreux EV plus grands ont tendance à être en petit nombre et peuvent ne pas être quantifiés. La capacité de quantifier les EV à faible contraste inférieur à 100 nm peut également être un facteur limitatif.
À mesure que de plus en plus de chercheurs utilisent des techniques d'analyse monoparticule spécialisées avec une sensibilité plus élevée, il devient de plus en plus clair que de nombreuses préparations EV présentent une distribution asymétrique à droite, par exemple une distribution log - normale, où la plupart des ev ont un diamètre < 100 nm. La plupart des techniques d'analyse monoparticule ne peuvent pas analyser la population EV dans son ensemble, de sorte queLes chercheurs devraient partager la distribution de diamètre EV détectée，Et pas seulement des indicateurs agrégés tels que la taille moyenne, la taille de la concentration ou la taille de la valeur médiane, ces indicateurs sont facilement inclinés en raison de la Lod et de la distribution de taille asymétrique. Veuillez noter,Les statistiques de taille ajustées, telles que les mesures par NTA sur les particules à bas indice, peuvent être plus proches de la Lod de l'instrument que du diamètre modal réel de la population EV.Les techniques utilisant des logiciels avec des algorithmes propriétaires pour déterminer la taille des particules peuvent également entraîner des différences entre les versions de logiciels ou les plates - formes logicielles, de sorte que le logiciel et ses versions devraient également être disponibles.La technique de dérivation de la taille à partir de l'hypothèse de l'indice de réfraction peut entraîner des variations en raison de différentes compositions et charges d'échantillonLa taille déduite d'une sonde fluorescente (par exemple, un colorant d'incrustation membranaire) peut alors varier en raison de l'incrustation de différents colorants sur la base de différents composants lipidiques membranaires. Pour les techniques qui ne permettent pas de distinguer les ve des co - isolats / contaminants, quelle que soit l'étape de séparation en amont, il est recommandé de formuler le rapport de diamètre comme étant le diamètre « particule » ou « EP » au lieu de « diamètre EV ».
- Si possible, utilisez des mesures orthogonales pour augmenter la crédibilité des résultats de distribution de taille.
- La distribution des diamètres des populations EV devrait être partagée, et pas seulement la taille moyenne, la taille de la concentration ou la taille médiane.
- Considérez la Lod de la méthode choisie et l'impact que cela peut avoir sur les données.
Publier l'impact possible des paramètres de l'instrument, de la plate - forme logicielle et de la version, ainsi que des réactifs de détection, en particulier des colorants incorporés.
Iii. Considérations relatives aux rapports techniques spécifiques de caractérisation EV
À mesure que l'utilisation et les connaissances spécialisées des expériences et des instruments de détection EV s'élargissent, la détermination d'échelles de rapport de caractérisation pertinentes augmente également pour assurer la fiabilité et la répétabilité des données. Les lignes directrices misev2023 détaillent une liste de précautions pour les expériences minimales et les rapports spécifiques aux instruments. Ceux - ci s'appliquent généralement indépendamment de la conception expérimentale. Les techniques énumérées ici ne sont pas exhaustives et de nombreuses techniques de détection sont en cours de développement ou sont activement étudiées. Cependant, les techniques énumérées sont toutes disponibles commercialement et il existe une littérature publiée de plusieurs chercheurs. (en raison de contraintes d'espace, l'auteur ne répertorie ici que les descriptions de plusieurs outils de caractérisation de la taille et de la concentration des particules EV couramment utilisés et leurs principaux points de vue.)[cytométrie en flux à base de microbilles]L'isev recommande que le groupe témoin comprenne des anticorps homotypiques comme anticorps de détection, ou des microbilles de capture couplées homotypiquement, et des microbilles de capture contenant uniquement des anticorps de détection (pour les billes de capture dans lesquelles les anticorps sont encapsulés); La concentration de l'échantillon sur plusieurs EV doit être utilisée pour démontrer le titrage du signal; Si des microbilles sont préparées, leurs réactifs et leur composition chimique doivent être publiés; Le catalogue et le numéro de lot des réactifs commerciaux de capture des microbilles sont également publiés; Publication des valeurs médianes d'intensité de fluorescence des microbilles normalisées; Publier des données et des statistiques sur les valeurs d'intensité de fluorescence médiane (comme pour la cytométrie en flux EV unique) de molécules de Fluorophore soluble équivalent (mesf) provenant de microbilles de délimitation monomorphes; Une méthodologie complète et détaillée devrait être publiée.[cytométrie en flux EV unique]En 2023, à l'initiative du Groupe de travail tri - sociétés (Groupe de travail sur la cytométrie de flux EV), composé de la société internationale des vésicules extracellulaires (isev), de la société internationale pour l'avancement du comptage cellulaire et de la société internationale de thrombose et d'hémostase, a été publié le Compendium de la cytométrie de flux EV unique, qui aborde de manière exhaustive les considérations relatives au développement de tests de cytométrie de flux EV unique.L'étalonnage des paramètres de volume d'échantillon, de fluorescence et de diffusion de la lumière est essentiel à l'interprétation et à la réplication des résultats de flux EV unique. Si la concentration de particules est rapportée à l'aide d'un cytomètre en flux EV unique, déterminez les limites supérieure et inférieure de la Lod pour permettre la répétition et la validation de ce résultat à l'aide d'une méthode orthogonale ou d'une autre personne.Actuellement, les cytomètres imageurs utilisent des méthodes de déclenchement dynamique, ce qui rend difficile la définition de la Lod inférieure et donc la normalisation.[Diffusion dynamique de la lumière]DLS， Également appelée spectroscopie de corrélation de photons (PCS) et diffusion quasi élastique de la lumière (qels), elle est une technique permettant de déterminer le diamètre hydrodynamique de particules suffisamment monodispersées en dispersion dans une solution aqueuse diluée. Le DLS mesure la fonction d'autocorrélation de l'intensité laser diffusée par plusieurs particules en solution. La fonction d'autocorrélation porte l'information sur le coefficient de diffusion des particules qui est liée au diamètre hydrodynamique par la théorie du Mouvement de Stokes - Einstein - Brown.Le coefficient de diffusion peut être dérivé de la fonction d'autocorrélation mesurée à l'aide de plusieurs algorithmes. La méthode la plus courante est l'analyse quantitative cumulative, maisIl suppose que les échantillons sont tous des distributions de taille monodispersées et que les échantillons EV ne possèdent pas de telles distributions.. pour la distribution de taille polydispersée de l'échantillon ev, la distribution des coefficients de la fonction d'autocorrélation déduite de la diffusion devient un problème mathématique inconfortable. Cela signifie queDLS ne doit pas être utilisé pour déterminer les propriétés quantitatives des échantillons EVà moins que DLS ne soit appliqué à une certaine partie de EV avec une seule taille de dispersion. D'autre part, le DLS peut être utilisé pour confirmer qualitativement la présence éventuelle de particules submicroniques et d'agrégats possibles dans un échantillon EV.[microscope électronique]Divers microscopes électroniques (EM) sont l'une des rares techniques capables de détecter ev, quelle que soit sa taille. Cependant, le flux des miroirs électriques signifie également que les EV plus grands seront sous - estimés statistiquement par rapport aux EV plus petits. Sem, TEM et cryo - em sont des méthodes de caractérisation EV haute résolution qui n'ont pas besoin de basculer entre elles ou de fournir des images de qualité comparable. Par exemple,Cryo - em peut clairement montrer la structure bicouche lipidique, maintient la morphologie EV mieux que les conditions de déshydratation utilisées par TEM pour fixer l'échantillon et peut être quantifié avec plus de précision (taille),Parce que toutes les particules dans un certain volume peuvent être imagées, pas seulement celles qui adhèrent à la surface du filet porteur.Il y a eu très peu d'études normalisées sur les méthodes em pour déterminer les faibles exigences en matière de rapports. Pour le Tem, trois paramètres principaux devraient être publiés: fixation, adsorption et méthode de coloration négative. La fixation comprend: l'agent de fixation utilisé, sa concentration et le temps d'incubation; L'adsorption comprend le matériau du réseau porteur, la taille du réseau porteur, le type de film, le revêtement, le temps d'incubation et les détails de lavage; Les détails de la coloration négative doivent inclure le substrat, la concentration et le temps d'incubation. En outre, les images à grossissement faible et élevé ainsi que les critères de sélection des images devraient être publiés.[Analyse de suivi de nanoparticules]NTA， Également considéré comme un suivi de particules unique, il s'agit d'une technique optique largement utilisée dans le domaine de l'EV pour estimer la taille et la concentration des particules. NTA utilise généralement un algorithme qui réduit la variation de la distribution du diamètre pour obtenir le diamètre hydrodynamique en mesurant le coefficient de diffusion des particules. Notamment,L'algorithme ftla utilisé sur certains appareils NTA a été développé pour mieux représenter les mélanges monodisperses, ce qui n'est pas le cas pour ev, ce qui peut entraîner de multiples distributions artificiellement ajustées.. et, il n'y a actuellement aucun moyen de déterminer ou de publier le Lod fixé par NTA. De nombreux chercheurs ont mené plusieurs études standardisées pour comparer les résultats entre les utilisateurs et les instruments.La mesure de la distribution du diamètre et de la concentration d'échantillons complexes de fluides biologiques à l'aide de NTA doit être interprétée avec prudenceParce qu'il compte les co - isolats tels que les lipoprotéines et les complexes macroprotéiques, etNTA a du mal à quantifier EV avec des diamètres supérieurs à quelques centaines de nanomètres- Oui.Pour les informations publiées sur le NTA, le modèle de l'instrument, le type de caméra, les paramètres de la caméra, la longueur d'onde du laser, la puissance du laser, la version du logiciel, les paramètres d'analyse et les particules par image doivent être inclus. Si elle est connue, alorsL'algorithme utilisé pour générer la distribution des diamètres doit être publié, car différents résultats peuvent être obtenus en fonction de l'algorithme utilisé.Dans le cas de modes de diffusion de la lumière ou de détection de fluorescence, il est recommandé d'utiliser un tampon vierge comme témoin. Pour les NTA fluorescents, le nombre total de particules en mode de diffusion de la lumière ainsi que le nombre de particules marquées en mode Fluorescent sont signalés, ainsi que la méthode d'élimination des marqueurs et le contrôle tampon / réactif, ce qui permet d'évaluer la situation des pseudo - couleurs marquées.Si un dispositif d'échantillonnage sur fluide est utilisé, son réglage doit également être publié- Oui.[induction d'impulsion de résistance]C'est la première fois que misev utilise la technologie d'induction par impulsions résistives (RPS) comme méthode de caractérisation des particules EV couramment recommandée, à côté des méthodes basées sur le flux (y compris le flux à base de microbilles et le flux EV unique) et des méthodes basées sur la microscopie (y compris la microscopie à force atomique, la microscopie électrique, DLS, NTA, Microscopie à super résolution, etc.). C'est aussi l'une des rares techniques de caractérisation EV qui n'a pas de principe optique.Le RPS utilise le principe de Kurt pour déterminer la concentration et le diamètre des particules, et certains appareils ont également une fonction de potentiel Zêta. Actuellement, le diamètre Lod du rps est aussi bas que ∼50 nm. La littérature rapporte,RPSLes résultats de mesure sont en effetTEMLes données ont un très haut niveau de cohérence.Lors de la Déclaration des données RPS, il est recommandé de publier le modèle de l'instrument, le diamètre des pores, le diamètre et la source des microbilles calibrées, ainsi que la version du logiciel. Comme indiqué précédemment (quantification de la taille des particules), pour les données ev,Il est recommandé de publier la distribution de diamètre du RPS plutôt que des statistiques de diamètre unique. Et il est recommandé d'incorporer un contrôle de tampon vierge pour identifier le fond, et des échantillons après lyse de la même concentration de décontaminant pour déterminer l'événement marqué. Étant donné que la technologie rps est facilement bloquée par des particules plus grosses, des étapes pré - analytiques telles que la centrifugation ou la filtration peuvent être utilisées pour éliminer les particules plus grosses. Étant donné que ces méthodes peuvent modifier la population EV analysée et influencer la comparaison avec les méthodes orthogonales, toute procédure de traitement pré - analytique doit être clairement indiquée.[méthode de Western Blot]Des informations détaillées sur l'enrichissement et la quantification des protéines doivent être fournies; Si possible, des contrôles positifs et négatifs de l'antigène doivent être inclus; Si une protéine est revendiquée pour être associée à ev, il est nécessaire d'inclure une mesure de pureté de la préparation EV. Signaler tous les détails de l'échantillon supérieur normalisé, de l'électrophorèse sur gel, de la méthode de transmembranage, des sondes et de l'imagerie / analyse (y compris, mais sans s'y limiter, les informations sur les anticorps, les conditions de dénaturation et de réduction de l'échantillon, la méthode de transmembranage, le type de membrane, les tampons et l'équipement et les paramètres d'imagerie); Fournir des images non recadrées de tous les Wb (requis comme information supplémentaire si publié dans un journal).Dans les sections ci - dessus, le Guide traite séparément des différentes méthodes de caractérisation des ve et fournit des recommandations spécifiques. Quelle que soit la méthode utilisée, les recommandations générales de caractérisation sont résumées comme suit:
- Chaque préparation EV doit être définie par une mesure quantitative de la source EV (par exemple, le nombre de cellules sécrétées, le volume de fluide biologique, la qualité des tissus, etc.).
- L'abondance des ve (y compris le nombre de particules, la teneur en protéines et / ou en lipides) doit être estimée.
- La préparation EV doit être testée pour détecter la présence de composants associés au sous - type EV ou ev, en fonction de la spécificité requise à des fins expérimentales.
- Déterminer le degré de présence de composants non vésiculaires et co - isolés.
- Lors de la caractérisation d'EV à l'aide d'indicateurs quantitatifs, la limite de détection (LOD) de l'instrument ou de la méthode doit être fournie.
