Total des plantesARNL'extraction est une étape fondamentale de la recherche en biologie moléculaire, dont la qualité détermine directement le séquençage du Transcriptome, la quantification de la fluorescence en temps réella PCRSuccès ou échec des expériences en aval. Cependant, les plantesParoi cellulaire dure, endogène actifRNaseEt les métabolites secondaires riches en polyphénols polysaccharidiques conduisent souvent à des méthodes d'extraction traditionnelles inefficaces. Particulièrement traditionnel broyage manuel d'azote liquide, il existe un faible flux de traitement, une mauvaise répétabilité des opérations, facile à déclencher par le réchauffement du broyageARNDes problèmes tels que la dégradation deviennent des goulots d'étranglement qui limitent la recherche.

Ce programme a construit un ensemble de paramètres de fonctionnement et de processus pour l'optimisation systématique du broyeur de tissus à haut débit de tableConcassage à haute efficacité, protection à basse température complète, sortie standardiséeSystème de traitement pré - échantillon tout - en - un conçu pour résoudre systématiquement les problèmes techniques ci - dessus.

I. résolution des difficultés techniques et mécanisme d'adaptation du broyeur

Pour une présentation claire des principes techniques de ce schéma, nous allons planterARNLes principaux défis de l'extraction par rapport au mécanisme de conception ciblée du broyeur sont les suivants:

II. Processus opérationnel normalisé (en prenant les feuilles des plantes comme exemple)

1. Préparation expérimentale

• Équipement et consommables: broyeur de tissus à haut débit de table (recommandé)7PoucesTFTÉcran tactile), adaptateur de pré - refroidissement à l'azote liquide, Perles Abrasives en zircone (diamètre3 à 5 mm), aucuneRNase 2 mLTube centrifuge,ARNKit d'extraction.

• Protection de sécurité: tout au long de l'opération, vous devez porter des gants anti - gel, des lunettes anti - choc et des vêtements de protection pour assurer la fermeture du couvercle de la machine, la fonction de freinage d'urgence est normale.

2. Principales étapes opérationnelles

1. Pré - traitement des échantillons: à aucunRNaseTable de travail, prenez50 à 100 mgFeuilles fraîches, coupées en1 à 2 mmFragments, rapidement mis en contenant1 mlLe liquide de lyse et1Dans le tube de centrifugation des perles Abrasives, le couvercle est serré et marqué.

2. Adaptateur pré - refroidi: immersion de l'ensemble de l'adaptateur placé symétriquement dans le tube échantillon dans de l'azote liquide1 - 2Minutes, jusqu'à ce que l'azote liquide cesse d'ébullition, assurez - vous que l'échantillon est congelé.

3. Réglage des paramètres de l'instrument: démarrez le mode basse température du broyeur, température de la cavité à cavité≤ - 30℃Après cela, réglez les paramètres: fréquence30 à 35 Hz, le temps45 à 60Secondes, activer l'accélération/Procédure de décélération (2Basculer en secondes).

4. Lancer le programme de broyage: retirer rapidement l'adaptateur de l'azote liquide (Cette étape au démarrage doit être contrôlée dans30Dans les secondes), installez et fermez immédiatement le couvercle de la machine, lancez le programme. Transférez rapidement le tube d'échantillon dans la boîte à glace lorsque vous avez terminé.

5. ARNRecyclage préliminairePour:4℃, 5000 tr/minCentrifugation30Secondes pour mélanger le lysat avec l'homogénat, puis directement dans le kitARNUne étape de purification.

3. Notes clés

• Contrôle du temps: garde stricte“or30seconde« etPrincipe, éviter de décongeler l'échantillon avant le démarrage.

• Le principe d'équilibre: tube d'échantillon placé symétriquement, la différence de poids d'un seul trou ne dépasse pas10 mg- Oui.

• Adaptation des paramètres: différentes organisations doivent optimiser les paramètres, en se référant spécifiquement au tableau ci - dessous:

planteARNExtraire la table d'optimisation des paramètres de broyage

Iii. Avantages du programme et évaluation de la qualité

1. Avantages de base

• Qualité stable: basse température complète et garantie de concassage efficaceARNIntégrité,En outreLa valeur est stable à8.5Ci - dessus (méthode traditionnelle environ6.0); Affichage électrophorétique sur gel d'agaroseARN r28S/18SLes bandes sont claires, aucune traînée de dégradation.

• Haute disponibilité, bonne pureté: par milligramme de tissuARNTaux d'acquisition4 à 6 μg,NanodropdétectionOD260/280Pour2,0 à 2,1,OD260/230 ≥ 1,8Réduction des résidus de Polysaccharides60%Ci - dessus.

• Grande efficacité: lot unique192Le broyage des échantillons n'est nécessaire que15Minutes, économisez80%Le temps; Coefficient de variation intra - Lot(CV)Inférieur à5%La répétabilité est plus élevée.

• Largement applicable: en ajustant les paramètres, il peut être adapté aux plantes spéciales à haute teneur en herbes, bois, algues et polyphénols (par exemple, arbre à thé, Ginseng).

2. Processus normalisé d'évaluation de la qualité

1. Intégrité: utilisationAgilent 2100Bioanalyseur,≥ 8,0(norme de séquençage du Transcriptome) ou≥ 7,0(ordinairela PCR) est qualifiée.

2. Pureté: détection par Spectrophotomètre UV,OD260/280Valeur du ratio1,9 à 2,2Et sans pics,OD260/230 ≥ 1,7- Oui.

3. Taux d'acquisition: dosage précis de la concentration par fluorescence, en combinaison avec le poids initial de l'échantillon pour calculer l'efficacité d'extraction.

Iv. Résumé et perspectives

Broyeur de tissus à haut débit de table par “Broyage haute fréquence-Protection contre les basses températures-Conception anti - pollution« et La triple synergie technologique a systématiquement attaqué les plantesARNLes quatre énigmes fondamentales de l'extraction. Son processus standardisé assure non seulementARNLa haute qualité des échantillons avec une grande stabilité, plus excellent flux pour les études de biologie moléculaire des plantes de grande taille (tels queGWASEt,ncARNRecherche) fournit un soutien solide.

À l'avenir, avec le développement du contrôle intelligent et de la technologie IOT, de tels appareils seront intégrésAISystème adaptatif paramétriqueLa correspondance intelligente des protocoles de broyage et la traçabilité en temps réel des données expérimentales conduisent la recherche botanique à un niveau plus élevé de normalisation, d'automatisation et d'intelligence.