Le synthétiseur d'acides nucléiques est l'équipement central de la recherche et du développement modernes en biologie moléculaire, en génomique et en biomédecine, permettant la synthèse efficace et précise de séquences spécifiques d'ADN ou de rnaoligonucleotides in vitro.Ses principes techniques combinent la technologie de synthèse en phase solide, la chimie organique et le contrôle automatisé de précision, permettant une « écriture à la demande» du Code génétique de la vie.

　　I. principe de base: méthode chimique du phosphonimide en phase solide

Les principales techniques actuelles de synthèse d'acides nucléiques sont toutes basées sur le principe de la synthèse en phase solide, dont le noyau est la méthode chimique du phosphonimide. Cette méthode, qui se caractérise par une efficacité élevée, un rendement élevé et une automatisation facile, remplace les méthodes antérieures de phosphodiester et de phosphodiester. L'ensemble du processus de synthèse est effectué à l'intérieur de la colonne de synthèse de l'instrument et la direction de synthèse de la chaîne cible est de l'extrémité 3 'à l'extrémité 5'.

Un cycle de synthèse comprend principalement quatre étapes essentielles:

1. Déprotection:

La synthèse commence par le premier nucléotide lié de manière covalente sur un support en phase solide. Le groupe 5 '- hydroxyle de ce nucléotide est bloqué par un Groupe protecteur. La première étape du cycle consiste à rincer la colonne de synthèse avec une solution acide, en retirant le Groupe protecteur DMT à l'extrémité 5 'du premier nucléotide et en exposant le groupe 5' - hydroxyle actif prêt pour la réaction de couplage suivante. Le cation DMT enlevé est orange et l'efficacité de la synthèse peut être contrôlée en ligne par photométrie.

2. Activation et couplage:

Ensuite, l'instrument pompe simultanément le prochain monomère nucléotidique à fixer et l'activateur dans la colonne de synthèse. Les monomères nucléotidiques eux - mêmes sont hautement activés, leur extrémité 3 'étant protégée par un groupe phosphimine et leur extrémité 5' par la DMT, avec un Groupe protecteur correspondant également sur la base.

L'activateur active le Groupe phosphoinimide 3 'du monomère nucléotidique, ce qui en fait un bon agent électrophile. Par la suite, il subit rapidement une réaction de Substitution nucléophile avec le groupe 5 '- hydroxyle déjà exposé sur le support en phase solide, formant une liaison phosphite - triester qui ajoute un nouveau nucléotide à la chaîne oligonucléotidique en cours d'allongement.

3. Couverture:

L'étape de couplage n'est pas efficace à 100% et il y a toujours très peu de chaînes de 5 '- Hydroxyles qui ne participent pas à la réaction. Ces séquences défaillantes, si elles ne sont pas bloquées, continueront à participer à la réaction dans les cycles suivants, produisant des sous - produits de la séquence manquante.

L'étape de "capuchon" utilise un mélange des deux réactifs pour désactiver en permanence le groupe 5 '- hydroxyle qui n'a pas réagi en le bloquant par acétylation. Ces courtes chaînes « capsulées » sont éliminées lors de la purification finale, ce qui améliore considérablement la précision de la séquence et la pureté du produit final.

4. Oxydation:

Le couplage de l'étape précédente forme une liaison triphosphate instable qui est facilement décomposée par l'acide. Cette étape passe à une solution mixte iode / eau / pyridine qui est oxydée en une liaison phosphotriester plus stable, complétant ainsi un cycle complet d'addition de nucléotides.

Ensuite, l'instrument répète automatiquement les quatre étapes ci - dessus de "déprotection → couplage → capuchon → oxydation", en ajoutant un nouveau nucléotide à chaque cycle jusqu'à ce que toute la séquence cible soit synthétisée.

　　II. Post - traitement de synthèse

Une fois le synthétiseur d'acide nucléique terminé l'assemblage des chaînes, le produit obtenu reste un brut d'ADN fixé sur un support en phase solide et tous les groupements étant protégés. Un traitement ultérieur est donc nécessaire:

1. Coupure et déprotection: traitement par une solution aqueuse concentrée d'ammoniaque, d'une part, les chaînes oligonucléotidiques synthétisées sont coupées du support CPG et, d'autre part, les groupes protecteurs sur toutes les bases et les groupes DMT aux extrémités des chaînes sont éliminés de manière synchrone.

2. Purification: selon les besoins de l'application, il peut être purifié par chromatographie liquide à haute performance (HPLC) ou électrophorèse sur gel de Polyacrylamide (page), etc. pour éliminer les séquences défaillantes et les sous - produits pour obtenir un produit final de haute pureté.

　　Iii. Résumé

L'essence du synthétiseur d'acide nucléique est un réacteur de chimie organique de précision hautement automatisé. Il permet une synthèse rapide, à haut débit et précise de l'ADN / rnaoligonucleotide en décomposant des réactions chimiques de synthèse complexes en une série d'étapes standardisées contrôlées de manière programmable et contrôlées avec précision par ordinateur pour le débit de liquide, la quantité de réactif utilisée et le temps de réaction. La maturité et la popularité de cette technologie ont grandement contribué au développement rapide de technologies de pointe telles que l'édition de gènes, les tests PCR, les médicaments à base d'acides nucléiques, le stockage de l'ADN, etc.