Diagramme anatomique du microscope à fluorescence Olympus

2018 / 7 / 26 7: 52: 45 publié par admin

Avec d'autres basés sur les caractéristiques de l'échantillon macroscopiqueMicroscope optiquePar rapport aux modes, tels que les gradients de phase, l'absorption de la lumière et la biréfringence, la microscopie à fluorescence est capable d'imager la distribution des espèces moléculaires individuelles en se basant uniquement sur les propriétés de l'émission de fluorescence. Ainsi, en utilisant la microscopie à fluorescence, il est possible de surveiller la position précise des composants intracellulaires marqués avec des fluorophores spécifiques, ainsi que leurs coefficients de diffusion associés, les caractéristiques de transport et les autres.BiologiqueInteractions des molécules. En outre, la réponse significative de la fluorescence aux variables environnementales locales permet d'étudier le pH, la viscosité, l'indice de réfraction, la concentration ionique, le potentiel de membrane et la polarité du solvant dans les cellules et les tissus vivants.

Configuration précoce du microscope à fluorescence avec transmission classique en champ clair ou sombre (Lumière transmise) etSystème optique, focaliser la lumière d'excitation à travers le filtre sur le plan de l'échantillon. L'émission de fluorescence est collectée à travers l'objectif ainsi qu'un grand nombre d'irradiations excitées et projetée dans le diaphragme de l'oculaire à travers un second filtre pour former une image intermédiaire. Parce que l'intensité de la lumière d'excitation est généralement de plusieurs ordres de grandeur supérieure à celle de l'émission de fluorescence, la vue de l'échantillon dans ces microscopes à lumière à transmission précoce est généralement très contrastée et superposée à un fond rempli d'une illumination d'excitation diffuse. L'illumination de l'échantillon à un azimut fortement incliné à l'aide d'un concentrateur de champ sombre immergé dans l'huile à ouverture numérique élevée a permis d'éliminer une grande partie du bruit de fond, mais n'a pas fourni un éclairage suffisant, à l'exception des objectifs à faible ouverture numérique. L'image résultante a une mauvaise résolution et une très faible luminosité.

Microscopie à fluorescence et lumière incidente (Lumière réfléchieOu Fallope) l'éclairage a été initialement développé à la fin des années 1920 pour observer l'émission de fluorescence dans des échantillons métallurgiques opaques. Comme leurs homologues à champ clair, ces instruments de fluorescence réfléchissante utilisent des séparateurs de faisceaux semi - réfléchissants qui ont une efficacité totale d'environ 25% (perte de 50% de l'éclairement après chaque passage dans un miroir). Cependant, les microscopes à fluorescence à réflexion présentent l'avantage d'avoir un objectif à grande ouverture numérique comme condenseur et de pouvoir produire des images de niveaux significativement plus élevés que les microscopes à lumière transmise fonctionnant à ouverture numérique similaire. De plus, la luminescence parasite stimulée réfléchie vers l'objectif (à ouverture numérique élevée) est réduite à quelques pour cent seulement. Le double rôle de l'objectif dans la microscopie à lumière réfléchie simplifie également considérablement la tâche d'alignement. Seule la focalisation de l'objectif sur l'échantillon établit le champ d'illumination et le champ de vision de sorte que la lumière incidente d'excitation et l'émission de fluorescence observée suivent le même chemin à travers la série optique du microscope.

Lorsque les lampes à décharge compactes à vapeur de mercure et à arc au xénon ont été développées au milieu des années 1930, les progrès technologiques dans l'éclairage des sources lumineuses ont entraîné une transition vers la fluorescence par réflexion (au moins pour la métallographie). Pendant cette période, les filtres en verre teinté et en gélatine deviennent également plus complexes, ce qui permet d'appliquer des colorants fluorescents excités par la lumière visible bleue et verte à l'aide de lampes halogénotungstène. Les revêtements antireflet et les formulations de verre améliorées ont conduit à des améliorations majeures dans la conception des objectifs dans les années 1940, mais une contribution fondamentale au développement de la microscopie à fluorescence incidente a été l'introduction du spectroscope dichroïque (également appelé dichroscope) qui a été lancé en 1948 par le scientifique optique russe eugeny brumberg. Cette innovation surmonte les problèmes de perte de lumière inhérents à l'utilisation de miroirs semi - réfléchissants ordinaires en microscopie à lumière réfléchie. La microscopie à fluorescence par réflexion a été largement commercialisée à la fin des années 1960 par Johan S. Ploem, qui a joué un rôle important dans le développement du Wild leitz Ploem opak, qui contenait plusieurs modules optiques interchangeables et contenait diverses combinaisons de filtres de microscopie à fluorescence.

Stratégies de base pour la microscopie à épifluorescence

La grande majorité des microscopes à fluorescence par réflexion sont des méthodes de sélection actuelles pour l'étude à large champ de sources de lumière incohérentes, ainsi que celles effectuées avec des instruments confocaux et multiphotoniques à balayage laser. Ce mode de microscopie à fluorescence populaire est également appelé Fluorescence incidente, fluorescence réfléchie ou simplement épifluorescence. Un microscope à fluorescence par réflexion moderne typique, également équipé pour l'observation de la lumière transmise dans divers modes d'amélioration du contraste, est représenté sur la figure 1. Le microscope contient une tête d'observation trinoculaire couplée à un système de caméra CCD (charge coupled device) avec deux sources d'éclairage, l'une pour transmettre la lumière et l'autre pour observer l'observation (tungstène - halogène et décharge d'Arc de mercure, respectivement). Le microscope conçu peut combiner ou alterner la fluorescence réfléchie avec le contraste de phase de la lumière transmise, le contraste interférentiel différentiel (DIC), la lumière polarisée ou l'observation du contraste modulé par Hoffmann.

La caractéristique essentielle de tout microscope à fluorescence est de prévoir un mécanisme d'excitation de l'échantillon avec un éclairage sélectivement filtré, puis de séparer les émissions de fluorescence les plus faibles à l'aide d'un deuxième filtre pour former une image avec une grande sensibilité sur un fond sombre. Dans de nombreuses expériences, les concentrations de sondes locales dans les échantillons biologiques sont très faibles, seule une petite partie de la lumière d'excitation est absorbée par la substance fluorescente. De plus, parmi les fluorophores capables d'absorber une certaine quantité d'irradiation, le pourcentage de fluorescence secondaire émise est encore plus faible. Le niveau de luminance d'émission de fluorescence résultant sera inférieur de trois à six ordres de grandeur au niveau de luminance de l'éclairage. Ainsi, le problème fondamental de la microscopie à fluorescence est de produire un éclairage efficace de l'échantillon tout en capturant une faible émission de fluorescence efficacement séparée de la bande d'irradiation plus intense. Ces conditions sont remplies dans les instruments fluorescents modernes par une combinaison de filtres qui coordonnent les exigences d'excitation et d'émission en fonction du rôle et des caractéristiques des séparateurs de faisceaux dichroïques.

La figure 2 décrit le principe derrière la fonction de séparateur de faisceau dichroïque (miroir) dans un microscope à fluorescence à réflexion contenant un échantillon fictif d'un Fluorophore qui excite et émet une fluorescence de longueur d'onde Rouge (620 à 660 nm) dans une zone verte (550 nm). Spectre visible. La source lumineuse à haute intensité délivre une large gamme de longueurs d'onde d'excitation à haute densité de flux (couvrant généralement la majeure partie de l'ultraviolet et l'ensemble du spectre visible) qui traversent l'illuminateur et rencontrent d'abord un filtre (noté EF; voir figure 2 (A)) qui sélectionne la bande d'excitation appropriée. Dans ce cas, le filtre traverse la lumière avec une grande efficacité avec des longueurs d'onde comprises entre 510 et 560 nanomètres, mais permet également le passage d'autres longueurs d'onde dans une moindre mesure. La lumière d'excitation atteint ensuite le miroir dichroïque (DM sur la figure 2) et est réfléchie dans le trou arrière de l'objectif pour former un éclairage conique qui éclaire l'échantillon. Les miroirs bicolores sont situés dans le chemin optique à un angle de 45 degrés et sont conçus pour réfléchir sélectivement les longueurs d'onde comprises entre 490 et 565 nanomètres (comme le montre la figure 3), tout en transmettant des longueurs d'onde plus courtes et plus longues.

La courbe de transmission d'une combinaison de filtres permettant de séparer la lumière d'excitation de l'émission de fluorescence de la figure 2 est représentée sur la figure 3. Le spectre du filtre d'excitation (courbe rouge) montre un haut niveau de transmittance (environ 80%) entre 510 et 560 nanomètres. Longueur d'onde centrale (CWL) 535 nm. Les miroirs dichroïques (courbes jaunes) réfléchissent les longueurs d'onde dans la région spectrale d'excitation tout en passant par les longueurs d'onde supérieures et inférieures avec une efficacité relativement élevée. Notez que le pourcentage de transmittance sur la courbe de miroir dichroïque correspond à 100% de réflexion. Une chute significative dans la distribution de transmission entre 490 et 570 nanomètres (qui représente le pic de réflectivité) est utilisée pour réfléchir la bande de longueurs d'onde entrant dans l'échantillon à partir du filtre d'excitation à un angle de 90 degrés. Ce dernier composant de la série optique, le filtre émissif ou barrière (courbe blanche), transmet des longueurs d'onde supérieures à 590 nanomètres, ce qui correspond à une lumière visible de couleur jaune, orange et rouge. La frontière entre les bandes de transmission et de réflexion des différents spectres superposés est conçue pour être la plus raide possible afin d'assurer une séparation quasi * des longueurs d'onde de réflexion et de transmission. Les motifs dans lesquels des pointes sinusoïdales montantes et descendantes apparaissent dans le spectre des miroirs dichroïques sont un effet courant du processus de dépôt de couches minces appelé sonnerie non - stop. Les performances de cette combinaison de filtres sont excellentes et témoignent clairement du développement rapide de la technologie des filtres interférentiels à couche mince.

Du fait que seule une faible bande passante de lumière est réfléchie par le miroir dichroïque, les longueurs d'onde d'irradiation inférieures à 490 nanomètres et supérieures à 565 nanomètres qui parviennent à traverser le filtre d'excitation sont également transmises par le miroir dichroïque, comme le montre la lumière au - dessus de la coupure. Figure 2 (A). Notez que la réflexion de la lumière d'excitation n'est pas efficace à 100%, de sorte qu'une petite quantité de lumière verte traverse le miroir dichroïque sans être réfléchie. De plus, toutes les longueurs d'onde supérieures à 565 ou inférieures à 490 nanomètres ne passent pas par le miroir. Une petite partie de cette lumière est réfléchie sur l'échantillon par le miroir à travers l'objectif.

L'émission de fluorescence de l'échantillon résultant de l'excitation de la lumière verte (principalement la longueur d'onde rouge) est agrégée par l'objectif et passe à travers un miroir dichroïque et un filtre barrière (au - dessus des rayons coupés dans la figure 2 (c)). Le filtre barrière (noté BF sur la figure 2) est spécialement conçu pour ne permettre qu'à la lumière de longueurs d'onde supérieures à 590 nanomètres d'atteindre l'oculaire et / ou le détecteur du microscope. Utilisé pour cette tâche, le filtre barrière empêche efficacement les longueurs d'onde de la lumière d'excitation réfléchie par l'échantillon (et traversant avec succès le miroir dichroïque) d'atteindre le détecteur. Cependant, la majeure partie de la longueur d'onde d'excitation renvoyée de l'échantillon est réfléchie par le miroir dichroïque (lumière en dessous de la lumière de coupure dans la figure 2 (c)) vers le filtre d'excitation et l'émetteur de lumière. L'effet net de la configuration du filtre illustrée sur les figures 2 et 3 est de séparer la lumière d'excitation d'intensité nettement plus élevée de l'émission de fluorescence plus faible. Dans tous les cas, comme représenté, le niveau de coupure du filtre impliqué dans la microscopie à fluorescence n'est pas, mais peut laisser pénétrer certains rayons lumineux en dehors de la gamme de longueurs d'onde. L'ensemble de la séquence d'événements est représenté graphiquement sur la figure 2 (b), où sont illustrés les chemins optiques et la disposition des filtres stratégiques nécessaires à un microscope à fluorescence par réflexion efficace.

Illuminateur Fluorescent vertical

Au cœur de la microscopie à fluorescence moderne se trouve l'illuminateur vertical universel à lumière réfléchie, qui est inséré dans le tube d'observation et porte l'objectifObjectifEntre les convertisseurs, comme représenté sur les figures 1 et 4. L'illuminateur est conçu pour diriger la lumière produite par les hautes lumières - en plaçant une source d'intensité sur l'échantillon en faisant d'abord passer la lumière à travers l'objectif du microscope vers la direction de l'échantillon, puis en utilisant le même objectif pour capturer la lumière émise par l'échantillon. Ce type de stratégie d'éclairage présente plusieurs avantages. L'objectif de microscope fonctionne d'abord comme un concentrateur bien corrigé, puis recueille l'émission de fluorescence imagée pour transmission à un oculaire ou à un système de détection de caméra. L'objectif est donc toujours correctement aligné par rapport à chaque fonction. De plus, la majeure partie de la lumière d'excitation diffusée ou réfléchie par l'échantillon (sur un angle de 360 degrés) est éloignée de l'élément lenticulaire avant de l'objectif plutôt que projetée directement dans le verre, comme c'est le cas pour l'irradiation par fluorescence transmise. Cet effet est appelé éclairage frontal et est particulièrement adapté aux spécimens épais. Après cela, la zone de spécimen illuminée est limitée à la même zone que celle observée, et l'éclairage et la collecte de lumière peuvent utiliser l'ouverture numérique complète de l'objectif.

À l'extrémité distale de l'illuminateur vertical se trouve une boîte à lumière (voir figure 4) contenant une source lumineuse à décharge d'Arc de haute intensité ou à incandescence à base de filament. La source lumineuse populaire est la lampe à arc au mercure haute pression de 100 watts (HBO, souvent appelée brûleur), mais les lampes à arc au xénon et aux halogénures métalliques, les lasers et les lampes à incandescence halogénures de tungstène peuvent également être utilisés à cette fin. La lumière émise par la source est focalisée par un système de lentilles à concentration et parcourt l'intérieur de l'illuminateur parallèlement à la table et perpendiculairement à l'Axe optique du microscope. La conception de l'émetteur lumineux représentée sur la figure 4 intègre un système de lentilles collectrices Multi - composants, mais met également en oeuvre des éléments lenticulaires asphériques pour améliorer la correction des aberrations chromatiques dans les régions proche infrarouge et ultraviolet. Un filtre thermique conçu pour supprimer ou supprimer les longueurs d'onde infrarouges est placé à l'intérieur de la boîte à lumière elle - même ou adjacent à un support de montage de la boîte à lumière à l'arrière de l'illuminateur vertical. De plus, certains microscopes comportent des systèmes à proximité de la boîte à lumière de l'équilibreur d'excitation bi - ou Multi - fréquence (voir figures 4 et 8) qui filtrent sélectivement les longueurs d'onde non désirées pour l'excitation afin d'affiner les performances du Banc de filtres fluorescents contenu à l'autre extrémité de l'illuminateur.

Également situé à proximité de la boîte à lumière dans l'illuminateur vertical se trouve un ensemble de filtres à densité neutre qui peuvent être utilisés pour réguler l'intensité totale de la lumière traversant le système et réduire la décoloration fluorescente ou le Photoblanchiment. Ces filtres sont généralement montés sur un châssis coulissant permettant leur insertion rapide et leur retrait du chemin optique tout en observant la fluorescence de l'échantillon. Pour établir l'éclairage Köhler, l'illuminateur vertical contient une combinaison d'une ouverture centrée et d'un diaphragme de champ de vision, tous deux avec une ouverture variable qui détermine la taille du champ et l'intensité de l'éclairage. Le centrage des diaphragmes d'ouverture et de champ et le réglage des dimensions des diaphragmes sont réalisés par plusieurs paires de boutons situés sur chaque côté extérieur du boîtier vertical de l'illuminateur. Dans certaines conceptions, un bouton coulissant est prévu pour retirer tout l'ensemble de l'ouverture du chemin optique afin de maximiser la quantité de lumière qui traverse l'illuminateur. D'autres microscopes contiennent des trous d'épingle de taille fixe, montés sur des glissières pour insérer des chemins optiques qui limitent considérablement le champ d'éclairage et conviennent à des applications spéciales telles que la récupération de fluorescence après Photoblanchiment (frap).

Après le diaphragme de champ et le diaphragme dans la série optique des illuminateurs verticaux se trouve la lentille de champ nécessaire pour diffuser la lumière et générer un champ d'éclairage suffisant pour établir un éclairage Kohler. Après le miroir de champ, tous les illuminateurs verticaux modernes contiennent un SAS (avec commande manuelle de commutation) qui empêche la lumière intense d'excitation d'atteindre le Groupe de filtres et l'échantillon lorsqu'aucune Fluorescence n'est observée ou enregistrée. L'obturateur est une caractéristique clé de la microscopie à fluorescence, car l'irradiation continue de l'échantillon peut réduire considérablement l'émission due au Photoblanchiment, alors que la lumière de haute intensité n'est pas saine pour les cellules vivantes. En outre, l'obturateur maintient la lampe à décharge d'arc active (réduisant le temps de préchauffage) Tout en examinant instantanément le spécimen avec la lumière transmise. Les microscopes à fluorescence sont généralement équipés d'obturateurs électroniques qui contrôlent rapidement et à distance l'éclairage. Un bouclier anti - UV (le masque respiratoire, indiqué sur la figure 4, est monté à l'avant du boîtier de l'illuminateur pour protéger l'opérateur contre les fuites accidentelles de rayonnement ultraviolet à ondes courtes potentiellement dangereux lorsque l'obturateur est ouvert. En protégeant le spécimen des gaz expirés pendant l'observation, le bouclier joue un double rôle.

Plusieurs conceptions d'illuminateurs verticaux offrent des fentes pour les cadres Polariseurs rectangulaires qui peuvent être utilisés pour l'étude de la polarisation de fluorescence. Dans la plupart des cas, le polariseur est inséré sur le chemin optique d'éclairage derrière le miroir de champ (loin du plan conjugué), mais avant le photogâchette (voir figure 4). Le polariseur peut être fixé en position avec un azimut de transmission prédéterminé ou monté sur un train d'engrenages permettant de changer l'orientation de l'axe de transmission par l'utilisation d'une molette. Le polariseur étant monté dans un cadre coulissant, il peut être facilement retiré du chemin optique lorsqu'il n'est pas utilisé. L'analyseur inclus (le deuxième polariseur nécessaire pour la mesure de l'anisotropie de fluorescence) peut être installé dans un illuminateur vertical au - dessus de la tourelle du bloc filtrant ou dans un tube intermédiaire spécialement conçu pour un microscope à polarisation. Le tube auxiliaire est généralement apte à être inséré dans un bloc polariseur rotatif dégradé pour assurer un positionnement précis de l'orientation de transmission de l'analyseur par rapport aux axes optiques du polariseur et du microscope.

Le dernier étage de l'illuminateur vertical contient un plateau tournant ou un support coulissant dans lequel est logé un bloc optique contenant une combinaison de filtres fluorescents. Lorsqu'il est nécessaire de combiner l'imagerie avec un filtre Fluorescent spécifique, le bloc de filtre tourne (ou glisse) dans la série optique. Un seul bloc contient un ensemble de filtres d'excitation et d'émission adaptés, ainsi que des spectroscopes dichroïques, tous soigneusement positionnés pour maximiser l'illumination de l'échantillon et capturer l'émission de fluorescence à des longueurs d'onde spécifiques. La tourelle de bloc optique et le support de coulisseau peuvent être chargés de trois à six blocs individuels, dont l'un est situé dans le chemin optique, tandis que les autres blocs tournent ou glissent hors du stockage temporaire. Ces accessoires permettent une transition rapide entre les groupes de filtres fluorescents lors de l'observation d'échantillons marqués avec deux sondes fluorescentes ou plus. L'utilisation de l'éclairage en transmission dans un microscope équipé d'un illuminateur Fluorescent est facilitée par des blocs optiques virtuels montés dans des fentes sur une tourelle ou un support de curseur. Le bloc virtuel bloque l'émission d'excitation (lorsque l'obturateur est ouvert), mais ne contient aucun filtre et permet à la lumière de passer librement de l'objectif à travers le tube d'observation.

Dans un microscope vertical modulaire standard, l'illuminateur vertical est situéMicroscopeEntre le cadre et le tube d'observation (voir figure 1). De nombreux fabricants proposent des tubes intermédiaires pouvant être insérés entre l'illuminateur et l'oculaire pour Polariseurs, prismes DIC ou autres accessoires. Les cadres de microscope modernes sont souvent le résultat d'efforts de conception assistée par ordinateur qui conduisent à une réduction significative des vibrations et à des caractéristiques ergonomiques améliorées. Les matériaux synthétiques, tels que les céramiques à matrice métallique et les composites d'aluminium, améliorent considérablement la rigidité statique et thermique du cadre, permettant ainsi à l'instrument de résister aux exigences rigoureuses des technologies de fluorescence avancées qui nécessitent l'élimination des vibrations sur une longue période * pour l'imagerie de faibles émissions de fluorescence.

Éclairage par microscope à fluorescence Köhler

Dans un illuminateur vertical fluorescent, la source lumineuse est positionnée de manière à ce que le filament ou la sphère de plasma à décharge d'arc se trouve à proximité du foyer principal de la lentille de concentration. Dans Köhler Lighting, les projecteurs fonctionnent comme des sources de lumière auxiliaires considérablement augmentées pour améliorer l'éclairage global. L'une des principales exigences de l'éclairage de Köhler est que l'image du filament ou de l'arc électrique doit être projetée sur le plan focal arrière de l'objectif, et qu'elle est également (généralement à ouverture numérique élevée) deux fois plus grande qu'un concentrateur lors de l'excitation de l'illumination par la lumière réfléchie. Idéalement, la source lumineuse devrait remplir toute l'ouverture de l'objectif pour amplifier l'intensité du rayonnement et créer un champ uniformément éclairé. Points chauds dans certains cas). Cependant, comme les filtres de diffusion réduisent également l'éclairement, ils doivent être évités autant que possible.

Dans un éclairage Köhler à lumière réfléchie (schématisé sur la figure 5), l'image de la source lumineuse est focalisée par une lentille de concentration sur un diaphragme à ouverture situé dans l'illuminateur vertical. Ce diaphragme partage un plan conjugué avec l'orifice arrière de l'objectif et l'Arc de lampe ou le filament et détermine ainsi la taille de l'ouverture de champ éclairée. La source lumineuse, le diaphragme d'ouverture vertical de l'illuminateur et le plan focal arrière de l'objectif (pupille) forment ensemble un groupe d'illumination de plans conjugués. Contrairement au cas de la microscopie à lumière en transmission, le diaphragme d'ouverture et la source lumineuse sont imagés sur le plan d'ouverture arrière de l'objectif (agissant comme un concentrateur) au lieu d'être physiquement situés à cet endroit. Comme avantage supplémentaire de cette configuration, lorsque l'objectif fournit une illumination d'excitation ou forme une image à partir d'une émission fluorescente agrégée, tous les obstacles, tels que l'iris, sont retirés du chemin optique. Le diaphragme d'ouverture ouvert ou fermé est utilisé pour contrôler la lumière parasite et réguler l'intensité de l'éclairage (ouverture numérique) sans modifier la taille du champ d'éclairage. Dans une image, le réglage du diaphragme d'ouverture affecte la luminosité et le contraste.

L'imagerie ou le Groupe de champs d'un plan conjugué dans un éclairage Köhler à lumière réfléchie se compose d'un diaphragme de champ, d'une surface d'échantillon et d'un plan d'image intermédiaire. Ainsi, lorsque le diaphragme de champ est focalisé au niveau du plan de l'échantillon, l'image de la source lumineuse est sensiblement retirée du foyer pour fournir un champ d'éclairage uniforme. Le diaphragme de champ de vision contrôle la taille du champ d'irradiation sans affecter l'intensité de l'éclairage de la zone observée. En pratique, les dimensions d'ouverture du diaphragme de champ doivent être aussi petites que possible afin d'augmenter le contraste de l'image et de réduire le degré de Photoblanchiment dans les zones non directement observées. Bien que la plupart des sources de lumière à décharge d'arc et à filament ne produisent pas une intensité d'éclairage uniforme, l'éclairage Köhler peut éclairer uniformément le champ de l'échantillon. Une fois le microscope correctement configuré, le plan focal arrière * de l'objectif est éclairé, offrant une zone uniformément lumineuse d'un bord à l'autre. Idéalement, Köhler Illumination baigne l'échantillon avec un ensemble de fronts d'onde convergents, chacun formé de points individuels sur la source lumineuse, qui sont imagés dans l'ouverture du condenseur. Dans un microscope à fluorescence correctement configuré, le résultat est le contraste et la résolution de l'image. Dans le cas idéal, les échantillons sont baignés d'un ensemble convergent de fronts d'onde, chacun créé par un point différent de la source de lumière imagée à l'ouverture du condenseur. Dans un microscope à fluorescence correctement configuré, le résultat est le contraste et la résolution de l'image. Dans l'idéal, les échantillons sont baignés avec un ensemble de fronts d'onde convergents, chaque front d'onde étant imagé àMiroir de concentrationCréé en différents points sur la source de lumière de l'ouverture. Dans un microscope à fluorescence correctement configuré, le résultat est le contraste et la résolution de l'image.

Sources lumineuses et phares

Pour une analyse quantitative rigoureuse en microscopie à fluorescence, l'irradiation de l'échantillon doit être constante dans le temps et dans l'espace tout au long du champ de vision. L'instabilité dans le temps reflète généralement les fluctuations du rayonnement de la lampe qui se produisent en raison des variations de la puissance de sortie. Inversement, les perturbations spatiales qui se produisent souvent dans les lampes à arc proviennent d'un phénomène appelé scintillation, car les billes de plasma se déplacent d'avant en arrière sur les électrodes. Le scintillement est généralement produit par des fluctuations de l'alimentation, de petites variations de la résistance de l'électrode ou des vibrations mécaniques. Les sources lumineuses à base de filament, telles que les lampes halogénures de tungstène populaires, sont très stables lorsqu'elles fonctionnent sous courant continu constant à l'aide d'une alimentation régulée en tension. En général, la source lumineuse doit être choisie parmi son contenu spectral, la taille du filament par rapport à la zone d'ouverture arrière de l'objectif, la stabilité spatiale et temporelle et l'uniformité de l'éclairage du champ. Une attention particulière doit également être accordée à l'intensité de la source lumineuse, car la longueur d'onde à bande étroite parcourue par le filtre d'excitation ne comprend qu'une très faible partie de la sortie totale du luminophore.

Les principales considérations pour le choix d'une source lumineuse pour la microscopie à fluorescence sont liées à ce qui a été étudiéColorants fluorescentsLe rendement quantique et l'absorption sont associés à la distribution spectrale de la lumière UV et visible. En outre, la source lumineuse doit être compatible avec la sensibilité du détecteur utilisé pour capturer l'image, qu'il s'agisse d'un œil humain, d'un film conventionnel, d'un tube photomultiplicateur, d'un tube vidéo amélioré ou d'un système de caméra numérique. Le choix dépend également du mode d'éclairage. L'utilisation d'une décharge d'arc ou d'une source tungstène - halogène répond aux exigences de la microscopie à fluorescence à large champ, tandis que la microscopie confocale et multiphotonique doit être adaptée à divers systèmes laser. L'utilisation de lampes à incandescence tungstène et tungstène - halogène a connu un succès limité, car la plupart de leurs émissions se produisent dans les régions rouges et infrarouges du spectre, tandis que la plupart des fluorophores sont excités par les longueurs d'onde ultraviolettes, bleues et vertes. En outre, les lampes à décharge à arc ont un rendement lumineux 10 à 100 fois plus lumineux que les lampes halogènes à quartz de 12 volts couramment utilisées pour l'éclairage par transmission lumineuse. Une source de lumière populaire pour la microscopie à fluorescence à grand champ est une lampe à arc à mercure, qui est généralement incluse dans la configuration de base du microscope modèle. Dans certains cas, des lampes à arc au xénon et aux halogénures métalliques sont utilisées, mais celles - ci sont généralement limitées aux cas particuliers où le spectre et la distribution de l'intensité correspondent aux exigences spécifiques du Fluorophore.

La conception des lampes au mercure et au xénon est similaire, à l'exception des dimensions physiques et du gaz dans le boîtier de l'ampoule. La lampe au mercure contient deux électrodes scellées à haute pression dans une ampoule en verre de quartz qui contient également du mercure élémentaire vaporisé. Lorsque l'alimentation est alimentée, une série d'impulsions haute tension est envoyée aux électrodes, ionisant une petite partie du gaz de mercure et allumant la lampe. Après cuisson, la tension diminue et le gaz ionisé est utilisé pour porter le courant et générer une sphère de plasma formée entre les deux électrodes. Pendant le travail de la lampe, l'évaporation du mercure produit beaucoup de chaleur et de pression à l'intérieur de l'ampoule de verre, produisant finalement une lumière de haute intensité. Les lampes à arc au mercure produisent des rayons lumineux, même continus dans le spectre ultraviolet et visible, concentrés sur les longueurs d'onde discrètes de 365 400 440 546 et 580 nm. De l'ultraviolet à l'infrarouge, les lampes au xénon ont une distribution d'intensité plus uniforme sur toute la gamme spectrale. Le choix du colorant Fluorescent est essentiel pour déterminer la source lumineuse appropriée pour la microscopie à fluorescence. Certaines sondes fluorescentes ont des bandes d'excitation qui coïncident avec des lignes de mercure saillantes, tandis que d'autres bénéficient d'une irradiation plus uniformément répartie de la lampe au xénon.

Un alignement correct des lampes à arc dans un microscope à fluorescence est essentiel pour obtenir un éclairage Kohler et éviter les zones claires et sombres dans l'image de fluorescence. Ainsi, la qualité de la boîte à lumière peut généralement être jugée par la stabilité d'un alignement correct de la lampe et par l'efficacité du bouton de réglage utilisé pour maintenir l'alignement. Le support de lampe doit être équipé d'une vis de centrage de la lampe pour centrer l'image en arc de cercle dans le trou arrière de l'objectif, et la boîte à lumière doit contenir un filtre infrarouge pour bloquer les longues longueurs d'onde dans le rouge lointain et l'infrarouge, ce qui génère beaucoup de chaleur. Certaines boîtes à lumière sont conçues avec un filtre anti - rougeâtre intégré (par exemple, Schott bg38) ou des fentes pour un tel filtre afin d'éliminer les arrière - plans rouges visibles à travers le champ de vision dans certaines applications. En outre, la boîte à lumière elle - même ne doit pas fuir les longueurs d'onde UV nocives et, de préférence, si le boîtier est ouvert involontairement pendant le fonctionnement, un interrupteur doit être inclus pour éteindre automatiquement la lampe. Après cela, la boîte à lumière doit être suffisamment solide pour résister à une éventuelle explosion du brûleur pendant le fonctionnement.

La grande diversité des applications de microscopie à fluorescence nécessite généralement une gamme de sources lumineuses pour répondre aux exigences des fluorophores spécifiques et des conditions d'imagerie. Dans certains cas, la combinaison avec un système de caméra ultrasensible peut nécessiter un rayonnement très faible, tandis que pour d'autres études, une forte excitation laser peut être nécessaire pour tuer les cellules vivantes ou blanchir sélectivement les fluorophores. Les exigences de longueur d'onde couvrent généralement toute la zone visible du spectre, ainsi que des Parties des rayons ultraviolets et infrarouges. Étant donné qu'une seule source lumineuse ne peut pas répondre à ces multiples exigences en matière d'éclairage, les fabricants proposent désormais des adaptateurs permettant de connecter simultanément deux lampes ou plus à un seul microscope.

Combinaison de filtres fluorescents

Comme indiqué précédemment, la lumière traversant la lentille et le diaphragme de l'illuminateur vertical rencontre finalement un filtre d'excitation logé dans un bloc optique positionné en coïncidence avec l'intersection axiale entre le chemin optique de l'illuminateur et le système optique du microscope. Le filtre d'excitation sélectionne une longueur d'onde à bande étroite à partir du large spectre produit par la lampe et les transmet à un miroir dichroïque qui, à son tour, réfléchit la lumière à travers l'objectif et l'éclaire sur l'échantillon. Avant la formation de l'image dans le diaphragme fixe de l'oculaire, l'émission de fluorescence recueillie par l'objectif traverse à nouveau le miroir dichroïque et le filtre émissif ou barrière. Les filtres couramment utilisés pour séparer les bandes dans la microscopie à fluorescence à large champ comprennent un filtre en verre coloré et un filtre interférentiel en film mince (ou une combinaison des deux). L'identification d'un filtre approprié pour chaque étape du Protocole d'éclairage et d'imagerie de la microscopie à fluorescence peut créer de la confusion en raison du grand nombre de fabricants de filtres impliqués, chacun offrant une nomenclature alphanumérique propriétaire pour la littérature sur la fluorescence.

Typique représenté schématiquement sur la figure 7Bloc d'excitation fluorescentL'anatomie, ainsi que les miroirs dichroïques, excitation et filtre barrière des profils spectraux associés. Les blocs filtrants sont généralement assemblés par des outils personnalisés fournis par le fabricant, de sorte que les opérateurs peuvent échanger les filtres et les miroirs dichroïques. Les filtres d'excitation et de barrière sont maintenus en place par des clips de fixation à colle optique ou à douille filetée circulaire (voir figure 7). D'une manière générale, il est possible de retirer ces filtres sans ouvrir le bloc optique car ils sont situés au - dessus de trous en creux sur la surface extérieure plane. Le remplacement du miroir dichroïque est plus difficile et nécessite * Le démontage du bloc pour accéder à l'intérieur. La plupart des sections de bloc sont coulées avec des joints diagonaux de 45 degrés, ce qui permet une double tâche en protégeant l'intérieur et en soutenant les miroirs dichroïques à un angle approprié. Après avoir retiré les fixations (chevilles ou petites vis) qui maintiennent les parties du bloc ensemble, le miroir peut être retiré en desserrant ou en déplaçant les clips de fixation, puis soigneusement retiré du bloc. Les miroirs dichroïques doivent être manipulés avec soin, car les revêtements interférentiels ne sont généralement pas protégés et peuvent facilement être rayés. Plusieurs fabricants de filtres qui fournissent des sociétés de microscopie offrent également une variété de filtres après - vente et de miroirs dichroïques pour une variété d'applications de fluorescence. Après avoir retiré les fixations (chevilles ou petites vis) qui maintiennent les parties du bloc ensemble, le miroir peut être retiré en desserrant ou en déplaçant les clips de fixation, puis soigneusement retiré du bloc. Les miroirs dichroïques doivent être manipulés avec soin, car les revêtements interférentiels ne sont généralement pas protégés et peuvent facilement être rayés. Plusieurs fabricants de filtres qui fournissent des sociétés de microscopie offrent également une variété de filtres après - vente et de miroirs dichroïques pour une variété d'applications de fluorescence. Après avoir retiré les fixations (chevilles ou petites vis) qui maintiennent les parties du bloc ensemble, le miroir peut être retiré en desserrant ou en déplaçant les clips de fixation, puis soigneusement retiré du bloc. Les miroirs dichroïques doivent être manipulés avec soin, car les revêtements interférentiels ne sont généralement pas protégés et peuvent facilement être rayés. Plusieurs fabricants de filtres qui fournissent des sociétés de microscopie offrent également une variété de filtres après - vente et de miroirs dichroïques pour une variété d'applications de fluorescence.

La conception de filtres fluorescents comprend des séries de filtres passe - long, passe - Court (filtres de bord), ainsi que des bandes étroites, moyennes et larges. Le spectre représenté sur la figure 7 montre des exemples de plusieurs profils de filtres courants. Le spectre du filtre d'émission de la figure 7 (courbe bleue) est réalisé à partir d'un filtre interférométrique passe - long ayant une longueur d'onde de coupure d'environ 575 nanomètres. Les longueurs d'onde plus longues sont transmises à travers le filtre, tandis que les longueurs d'onde plus courtes sont bloquées. Un filtre d'excitation passe - bande étroite (courbe rouge, figure 7) du même groupe a une largeur de bande d'environ 20 nanomètres, tandis qu'un miroir dichroïque (courbe verte) a une zone de transmission approximativement moyenne (455 - 490 nanomètres) et un filtre passe - bande large (560 - 775 nanomètres). Parce que les miroirs dichroïques fonctionnent efficacement comme des filtres passe - long dans le vert, les zones jaunes et rouges du spectre visible (560 à 700 nm) sont traitées dans le jeu de filtres. Une connaissance pratique de la façon d'utiliser la distribution spectrale d'absorption et d'émission du Fluorophore pour sélectionner le jeu de filtres de microscopie à fluorescence approprié est * nécessaire pour une mise en œuvre réussie de cette technique.

Les miroirs dichroïques (ou miroirs séparateurs de faisceaux) sont des composants clés de la combinaison de filtres de microscopie à fluorescence, similaires aux filtres de type interférométrique passe - long, fabriqués avec des tolérances de matériaux diélectriques multicouches. La principale différence entre un miroir dichroïque et un filtre interférentiel standard est que le miroir est spécialement conçu pour la réflexion et la transmission à des longueurs d'onde limites définies et doit fonctionner à un angle de 45 degrés par rapport aux axes optiques du microscope et de l'émetteur de lumière. Le miroir dichroïque est positionné de manière à ce que le revêtement interférentiel soit en regard de la source lumineuse d'excitation de manière à réfléchir une courte longueur d'onde d'excitation à l'échantillon à un angle de 90 degrés par l'intermédiaire du système optique. Le même miroir doit également agir comme un filtre de transmission pour transmettre l'émission de fluorescence à longue longueur d'onde de l'objectif au plan image. Parce que la zone de transition de longueur d'onde entre la réflexion presque totale et la grande transmission est généralement limitée à 20 ou 30 nanomètres, les miroirs dichroïques sont capables de distinguer avec précision les longueurs d'onde d'excitation et d'émission.

La conception d'un banc de filtres fluorescents permet une adaptation précise de la bande de longueur d'onde d'excitation spécifique à la zone de réflexion dans le miroir dichroïque. Le résultat est que la lumière d'excitation est réfléchie efficacement sur l'échantillon par microscopie. L'émission de fluorescence de l'échantillon doit être adaptée à la zone de transmission élevée dans le miroir dichroïque pour permettre à ces longueurs d'onde de traverser le détecteur. Les filtres barrières sont moins importants dans l'ensemble du Protocole, mais jouent néanmoins un rôle important pour assurer l'élimination des longueurs d'onde d'excitation diffusées et réfléchies, la fluorescence provenant de sondes autres que la cible et l'intensité générale du fond due à la fluorescence spontanée. Un facteur important dans la création d'un banc de filtres est d'assurer la transmission, la réflexion, la courbe d'émission du filtre en question correspond à la courbe d'émission de la zone correspondante. Sinon, la longueur d'onde d'excitation peut traverser le miroir dichroïque et rendre l'image floue, ou l'émission de fluorescence peut être réfléchie involontairement au niveau du miroir pour nuire à la luminosité de l'image.

Même dans des combinaisons de filtres apparemment parfaitement adaptées, un léger chevauchement entre les distributions spectrales des différents filtres peut se produire, ce qui réduit les performances. Une préoccupation particulière est la diaphonie entre le filtre d'excitation et le miroir dichroïque, qui permet à une partie de la lumière d'excitation de traverser le miroir et de se réfléchir sur les parois du bloc de filtre. Comme indiqué ci - dessus, la lumière réfléchie à un angle d'inclinaison élevé peut traverser partiellement le filtre barrière pour réduire le contraste de l'image. Cette fuite à travers le filtre est appelée infiltration ou croisement en fait toutes les combinaisons de filtres se produisent plus ou moins. L'un des principaux domaines d'intérêt pour les fabricants de filtres et les entreprises de microscopie est l'amélioration de la conception des combinaisons de filtres fluorescents pour réduire les niveaux de croisement.

Plusieurs configurations du jeu de filtres fluorescents sont représentées sur la figure 8. La tourelle de blocs de filtres (Figure 8 (A)) contient cinq blocs qui peuvent être convertis rapidement entre les combinaisons de filtres tout en étudiant au moins ce nombre de fluorophores. L'une des rainures de tourelle est généralement remplie d'un bloc optique virtuel ou laissée vide pour l'observation de la lumière transmise. Le spectre d'excitation est affiné à l'aide d'un équilibreur d'excitation (Figure 8 (b)) pour l'imagerie d'échantillons doublement ou multiplexés contenant un seul filtre interférentiel monté sur un joint tournant. La rotation de la tige de réglage de l'équilibreur d'excitation déplace la zone de transmission passe - bande du filtre vers une longueur d'onde plus courte. Ainsi, lorsque le filtre d'équilibrage est tourné d'un angle d'incidence de zéro degré (perpendiculaire à l'axe vertical de l'illuminateur) à un grand angle de rotation de 45 degrés, la zone passante du filtre peut être déplacée d'une valeur comprise entre 25 et 50 nanomètres. L'équilibreur d'excitation peut être utilisé seul ou en série pour faire varier la bande passante d'excitation du colorant Fluorescent observé de manière à égaliser les intensités d'émission. Cette caractéristique permet d'affiner l'intensité du Fluorophore dans un échantillon contenant plusieurs sondes, par example en diminuant l'émission de fluorescence d'une sonde tout en augmentant l'intensité de l'autre. L'équilibreur d'excitation peut être utilisé seul ou en série pour faire varier la bande passante d'excitation du colorant Fluorescent observé de manière à égaliser les intensités d'émission. Cette caractéristique permet d'affiner l'intensité du Fluorophore dans un échantillon contenant plusieurs sondes, par example en diminuant l'émission de fluorescence d'une sonde tout en augmentant l'intensité de l'autre. L'équilibreur d'excitation peut être utilisé seul ou en série pour faire varier la bande passante d'excitation du colorant Fluorescent observé de manière à égaliser les intensités d'émission. Cette caractéristique permet d'affiner l'intensité du Fluorophore dans un échantillon contenant plusieurs sondes, par example en diminuant l'émission de fluorescence d'une sonde tout en augmentant l'intensité de l'autre.

Le développement rapide de la technologie de revêtement en couches minces peut être démontré par la capacité de générer plusieurs pics de transmission dans un seul filtre interférentiel et de créer des bandes de réflexion et de transmission entrelacées dans un miroir dichroïque. Lorsqu'ils sont convenablement adaptés, les deux filtres multibandes et les miroirs dichroïques peuvent être combinés pour produire plusieurs groupes de filtres fluorescents capables d'exciter et d'observer simultanément l'émission de plusieurs fluorophores. Les bancs de filtres sont disponibles auprès du fabricant et conviennent à deux, trois voire quatre fluorophores dans le même échantillon. Le principal problème avec plusieurs bancs de filtres est leur coût et l'excès de croisement ou de perméation qui se produit lorsque l'émission d'une sonde fluorescente traverse une zone passe - bande pour l'autre. Dans certains échantillons (et groupes de filtres), la pénétration a un effet significatif sur la force de fond et le contraste de l'image. De nombreux chercheurs ont tendance à utiliser des ensembles de filtres optimisés pour Imager chaque Fluorophore séparément, puis combiner les images en complexes.

Les techniques avancées de fluorescence nécessitent généralement l'utilisation de plusieurs filtres d'excitation et d'émission avec un seul miroir dichroïque. Pour faciliter ces études, de nombreux microscopes à fluorescence sont équipés de roues ou de curseurs motorisés contenant six filtres individuels supplémentaires (voir figure 8 (c)). Un microscope conçu pour un curseur comporte soit une fente spéciale dans l'illuminateur vertical pour l'insertion du curseur, soit un curseur de filtre peut remplacer un curseur contenant généralement un filtre à densité neutre. Dans certaines conceptions de microscope, le luminophore vertical peut également contenir un curseur émissif, ou un tube intermédiaire auxiliaire monté entre le luminophore et le tube d'observation pour contenir le curseur. En microscopie verticale et inversée, une cellule de filtre motorisée contenant un filtre d'excitation est généralement prise en sandwich dans la voie optique verticale de l'illuminateur entre le filtre de densité neutre et la boîte à lumière. De même, la cellule de filtre d'émission motorisée est placée entre l'illuminateur vertical et le tube d'observation oculaire dans une conception de microscope vertical, mais est généralement reliée par le même port externe que le détecteur utilisé pour inverser l'instrument. Les curseurs d'excitation et d'émission et les roues filtrantes motorisées sont utiles pour les applications à double et triple excitation utilisant un seul miroir bicolore. En éliminant la nécessité de repositionner les blocs de filtre lors de l'observation d'un seul échantillon, ces accessoires permettent aux chercheurs d'obtenir un recalage précis entre les images.

Objectifs pour microscope à fluorescence

Dans toutes les formes de microscopie à lumière réfléchie (y compris la fluorescence), l'intensité de l'image est fonction de l'ouverture numérique et du grossissement de l'objectif. En pratique, l'intensité ou la luminosité (définie comme le flux de photons par unité de surface et de temps) augmente le quadruple carré de l'ouverture numérique, mais seulement inversement proportionnel au carré du grossissement:

Intensité α (Na obj) 4 / M 2

Où na est l'ouverture numérique de l'objectif et M. est le grossissement. De cette relation, il est évident que l'image fluorescente lumineuse sera composée deOuverture numériqueEt une agrégation d'objectifs à faible grossissement (par exemple 0,75 / 20x). Par exemple, un objectif à immersion d'huile apochromatique planifiée 60x avec une ouverture numérique de 1,4 produira théoriquement une image plus lumineuse qu'un objectif 100X avec la même ouverture numérique, mais un compromis doit être pris en compte. L'augmentation du nombre d'éléments de lentille interne (comme pour les objectifs à ouverture numérique élevée) produit une augmentation correspondante de la fluorescence spontanée et de la réflexion de réduction d'intensité de la surface de la lentille interne. En règle générale, les fabricants font un compromis entre un facteur positif et une transmission lumineuse accrue dans leurs microscopes à fluorescence recommandés.

En général, l'huile à haute ouverture numérique (1,3 à 1,4) et l'eau (1,2) immergées dans la fluorite planifiée et les objectifs apochromiques plans produisent des images fluorescentes brillantes en raison de leur grande capacité de concentration. Ces objectifs présentent une excellente correction des couleurs et sont donc capables de focaliser plusieurs longueurs d'onde d'émission de fluorescence dans un même plan. Les propriétés lenticulaires de l'apochromie et des objectifs en fluorite sont * jusqu'à environ 350 nm, ce qui est nécessaire pour examiner les colorants fluorescents excités dans la région ultraviolette (par exemple dapi, Hoechst, Alexa Fluor - 350 et AMC). Bien qu'il existe de nombreux objectifs internes, ces objectifs sont fabriqués à partir de verre faiblement Fluorescent avec un revêtement antireflet pour minimiser la fluorescence de fond et produire des images très contrastées.

Les objectifs conçus pour des applications spéciales sont largement utilisés dans la microscopie à fluorescence. Cette catégorie comprend l'immersion dans l'eau à ouverture numérique élevée, l'immersion multiple (huile, eau et glycérine), et les objectifs UV avec des éléments de lentille en quartz. Pour les applications d'imagerie de cellules vivantes, des objectifs à longue distance de travail avec des anneaux de correction sont nécessaires pour observer les échantillons à travers les parois épaisses (0,5 - 2 mm) des flacons de culture. L'examen en profondeur d'échantillons épais est facilité par des objectifs à très longue distance focale (distance de travail) qui peuvent être obtenus auprès de plusieurs fabricants pour l'imagerie à travers des lunettes recouvertes d'air ou d'eau. Les objectifs immergés dans l'eau à longue distance conçus pour fonctionner sans lames ont également un cône frontal en Teflon, ce qui permet d'immerger l'objectif dans une solution aqueuse. Un objectif similaire a été réalisé pour une excitation UV (340 nm) dans l'eau à une distance de travail de 20 à 30 mm, y compris environ 5 mm d'eau. Pour les études de grossissement relativement faible, il est recommandé d'utiliser un objectif immergé dans l'eau 20x avec * Ouverture numérique (0,75 à 0,95). Bien que très coûteux, ces objectifs produisent des images extrêmement lumineuses avec des concentrations de fluorophores et / ou des rendements quantiques négligeables.

Accessoires pour microscope à fluorescence

Les fabricants produisent constamment des unités d'accessoires supplémentaires utiles pour leurs instruments afin d'augmenter le choix disponible pour les applications d'imagerie en croissance dans la microscopie à fluorescence. Par example, sur certains microscopes, on peut choisir un diaphragme de champ rectangulaire (voir figure 9) qui permet de limiter la zone de l'échantillon éclairée pour améliorer le contraste et réduire le Photoblanchiment. Au lieu d'un diaphragme à diaphragme traditionnel (également un module amovible) dans un illuminateur vertical, un diaphragme de champ modulaire est conçu pour correspondre au rapport d'aspect d'un capteur d'imagerie numérique. L'arrêt du champ rectangulaire améliore l'efficacité de l'éclairage Kohler et réduit le rapport signal / bruit du capteur électronique. Comme avantage supplémentaire, la taille du rectangle de l'image peut être ajustée pour correspondre au pas de la phase lors de l'utilisation de la phase de balayage Programmable dans les études de déconvolution. Les trous d'épingle ressemblent à des diaphragmes de champ rectangulaires et peuvent être utilisés pour des applications nécessitant un champ d'éclairage très restreint.

D'autres accessoires comprennent un adaptateur de boîtier double lampe qui permet de connecter simultanément deux sources lumineuses, telles que les lampes à décharge à arc au mercure et au xénon, à un illuminateur vertical. Les illuminateurs adaptés aux lasers d'excitation peuvent également être utilisés dans des applications telles que la fluorescence par réflexion interne totale (tirf), la microscopie d'imagerie à vie par fluorescence (FLIM), l'imagerie proportionnelle et les expériences de récupération du Photoblanchiment. En outre, la plupart des microscopes à fluorescence de qualité de recherche offerts par les principaux fabricants s'adaptent facilement à leurs accessoires confocaux respectifs à balayage laser. Un microscope vertical accepte une cellule de balayage confocale via un tube d'observation trinoculaire, tandis qu'un instrument inversé peut connecter le scanner de faisceau à un port latéral ou arrière du cadre du microscope. Un double port inséré entre l'illuminateur vertical et le tube d'observation peut être utilisé pour introduire une source lumineuse supplémentaire ou diriger la fluorescence vers plus d'un détecteur. La plupart de ces unités sont livrées avec un adaptateur de montage de type C en option ou un accessoire de port de microscope standard.

Les microscopes à fluorescence conçus pour l'étude de l'électrophysiologie sont devenus très complexes. Beaucoup sont équipés d'un étage d'absorption de choc spécialisé qui peut accepter une variété d'accessoires de micromanipulateur pour l'utilisation de la fluorescence, des expériences de contraste interférentiel différentiel infrarouge (IR - DIC) et des techniques traditionnelles d'imagerie améliorée par contraste en champ clair. Le Carrousel zooscopique pendulaire permet un échange rapide et sans vibration de l'objectif pour éviter l'intrusion de spécimens ou de bulles perturbateurs lors de l'imagerie de cellules et de tissus vivants. L'observation macroscopique fluorescente des organismes vivants est possible grâce aux nouveaux objectifs macro 2x et 4x à grande ouverture numérique, équipés de blocs de combinaison de filtres spécialisés. En outre, certains fabricants offrent également des illuminateurs verticaux fluorescents et des ensembles de filtres comme accessoires à leurs stéréomicroscopes.

Un facteur de grossissement de 1,25x à 1,5x peut parfois être sélectionné en option pour les illuminateurs verticaux, mais en raison des problèmes inhérents à l'introduction d'un grossissement à vide, il convient d'éviter autant que possible d'utiliser des lentilles auxiliaires pour accéder aux images fluorescentes. Plusieurs conceptions d'illuminateurs verticaux modulaires comportent des moyens de connexion d'un module séparateur de faisceau contenant plusieurs ports de caméra au - dessus de l'illuminateur pour augmenter les capacités d'imagerie. Compte tenu de la variété d'accessoires motorisés maintenant disponibles pour la microscopie à fluorescence, y compris les carrousels d'objectif, les concentrateurs, les roues de filtre et les plates - formes, les chercheurs ont accès à des techniques d'imagerie plus sophistiquées que jamais. Les fabricants ont investi beaucoup d'efforts dans la conception d'accessoires pour de nombreuses applications de fluorescence complexes qui ne pouvaient autrefois utiliser que des microscopes construits avec * pièces provenant de diverses sources. Alors que la microscopie à fluorescence devient un outil de plus en plus important dans les domaines de la biologie cellulaire, de la neurophysiologie et de la clinique

Conception de microscope à fluorescence inversée

Une version similaire de l'illuminateur Fluorescent vertical peut être utilisée pour inverser (culture tissulaire) le support de microscope. Le support inversé permet également une combinaison ou une alternance entre les différentes techniques d'amélioration du contraste de la photofluorescence réfléchie et de la photomicroscopie à transmission. Microscope inversé de qualité de recherche avec plusieurs (plus de six) ports d'entrée / sortie, généralement un seul port de chaque côté du cadre, et un ou deux ports à l'arrière (supérieur et inférieur) et un microscope à Port inférieur sous le fond dans certains modèles, l'image principale peut être obtenue simultanément à partir de trois ports ou plus sans l'utilisation d'un objectif relais. Ce niveau de connexion permet d'effectuer des analyses de fluorescence complexes à l'aide de plusieurs sources lumineuses, d'une roue filtrante et d'un système de caméra. Les abat - jour au mercure et au xénon pour microscope inversé peuvent être utilisés avec des lentilles de concentration Multi - éléments ou asphériques standard pour améliorer les performances et réduire les aberrations dans les régions spectrales UV et IR. En outre, divers adaptateurs de boîte à lumière peuvent être utilisés pour connecter plusieurs sources d'éclairage, similaires aux accessoires disponibles pour les microscopes verticaux.

La figure 10 montre une vue schématique en Coupe d'un microscope à fluorescence inversé moderne (culture de tissus) équipé d'un capteur d'image CCD refroidi par Peltier et d'un système de caméra de film 35 mm traditionnel. Malgré le filmCaméraLes utilisations sont limitées, mais la plupart des microscopes inversés comprennent toujours des ports pour ces accessoires dans la partie inférieure de la base avant. Le microscope représenté sur la figure 10 peut utiliser une boîte à lumière tungstène - halogène montée sur un mât pour réaliser un éclairage classique en transmission à champ ouvert (avec ou sans renforcement du contraste). Les lampes à décharge à arc au mercure ou au xénon sont utilisées dans la microscopie à fluorescence à l'aide d'un illuminateur à lumière réfléchie connecté à un port arrière spécialement configuré. Les diaphragmes d'ouverture et de champ, ainsi que les filtres de densité neutre, entrent près des ports à l'arrière du microscope. Dans certains modèles de microscope inversé (non représentés), un illuminateur à lumière réfléchissante en forme de l contenant un diaphragme médian peut être utilisé pour améliorer l'accès au port auxiliaire arrière pour des accessoires supplémentaires. Le chemin optique à travers le microscope de la figure 10 est représenté en jaune pour la lumière transmise, en violet pour l'éclairage par lampe à arc non filtrée, en vert pour l'excitation fluorescente filtrée et en rouge pour l'émission fluorescente.

Les cadres de microscope inversés modernes, comme leurs homologues droits, sont des matériaux composites conçus et fabriqués par ordinateur pour la stabilité structurelle et thermique. En outre, les composants de la plate - forme mécanique et la structure du circuit sont conçus avec des distances de course courtes et une rigidité élevée pour éviter le tangage et le lacet lors de la manipulation du déviateur d'objectif dans des opérations classiques telles que par example l'insertion d'un prisme DIC ou le réglage de la bague de correction d'objectif. La phase avancée de Carrousel d'objectif permet l'élimination pratique de la dérive de mise au point dans le délai et l'observation fluorescente prolongée. D'autres options de mise en scène qui ne sont pas disponibles avec un microscope vertical standard comprennent des scènes coulissantes et rotatives à 360 degrés, des Inserts de scène en verre, des plaques chauffantes, des boîtes de pétri et des supports de plaque et des incubateurs de dioxyde de carbone.

Le microscope inversé avec la conception modulaire peut être facilement configuré pour l'étude de l'électrophysiologie, de la fécondation in vitro, de la micromanipulation, de la DIC haute résolution, de l'observation vidéo améliorée et de diverses techniques de fluorescence avancées. Ces instruments sont également facilement adaptables aux microscopes confocaux et multiphotons. Les accessoires électriques comprennent des stores, des roues filtrantes, un carrousel d'objectif rotatif, un carrousel de bloc fluorescent, un pilote de mise au point et un concentrateur. Lorsqu'il est combiné avec des objectifs avancés à haute distance de travail, immersion dans l'eau, excitation UV et contraste de phase, tous avec une correction optique élevée, le microscope inversé est l'instrument idéal pour effectuer des études de fluorescence sur des cellules et des tissus vivants.

conclusion

En microscopie à fluorescence, les variations importantes entre les concentrations locales de fluorophores dans un échantillon, combinées à des différences dans les coefficients d'extinction et les rendements quantiques d'un colorant fluorescent à l'autre, affectent considérablement le signal d'émission produit pour une quantité donnée d'intensité d'excitation. Étant donné que de nombreux échantillons ne contiennent que des traces de matériau Fluorescent dans un champ de vision particulier, ces facteurs combinés produisent des niveaux moyens d'émission de fluorescence de 4 à 6 ordres de grandeur inférieurs à l'intensité d'excitation. En outre, il existe des techniques de fluorescence plus complexes, telles que l'hybridation in situ et le transfert d'énergie par résonance (fret), pour lesquelles l'intensité du signal émis peut être inférieure de 9 à 10 ordres de grandeur à celle du signal émis excité. Pour compenser ces grandes différences entre l'intensité d'excitation et l'intensité d'émission, les microscopes à fluorescence modernes doivent être capables d'atténuer l'irradiation d'excitation plus d'un milliard de fois sans perturber le signal de fluorescence.

L'une des principales caractéristiques de la microscopie à fluorescence est la haute spécificité des sondes fluorescentes qui absorbent et émettent de la lumière à des longueurs d'onde caractéristiques, ce qui permet à cette technique de détecter sélectivement des espèces d'objectifs à très faible concentration dans des mélanges complexes. De plus, la haute sensibilité et la résolution spatiale de la fluorescence permettent de localiser et d'étudier avec précision des molécules individuelles sur des échelles de longueur inférieures à la résolution optique du microscope. Les facteurs environnementaux locaux affectent également fortement l'émission de fluorescence, de sorte que la méthode est la sonde idéale pour les fluctuations de pH, de viscosité, de concentration ionique, de distance et d'orientation moléculaire, de potentiel de membrane, d'hydrophobicité, de distribution de charge et de coefficient de diffusion. La résolution temporelle de la fluorescence est limitée à la durée de vie de la sonde fluorescente excitée, qui peut être de l'ordre de la nanoseconde. Comme de nombreux processus biologiques se produisent dans ce domaine temporel, la dynamique de désintégration peut révéler des informations dynamiques sur les processus cellulaires. Dans l'ensemble, ces facteurs sont essentiels dans l'application de la microscopie à fluorescence à la biologie cellulaire.

Au cours de la dernière décennie, la microscopie à fluorescence a évolué à un rythme alarmant, tout en évoluant tout aussi rapidement dans la technologie laser, les détecteurs à l'état solide, la fabrication de films minces interférentiels et l'analyse d'images par ordinateur. Le développement d'objectifs immergés dans l'eau à ouverture numérique élevée contribue davantage à l'étude des phénomènes biologiques, permettant aux chercheurs de sonder en profondeur les cellules vivantes dans leur environnement naturel. Alors que les fabricants de microscopes répondent aux besoins changeants de la communauté de la recherche, le développement d'instruments et d'accessoires fluorescents avancés continuera sans aucun doute d'évoluer et leur contribution finale à l'exploration des mystères de la nature pourrait finir par avoir des implications profondes.