Les instruments de PCR quantitative par fluorescence (QPCR) sont des dispositifs de base dans des domaines tels que la recherche en biologie moléculaire, le diagnostic clinique (par exemple, la détection du nouveau coronavirus), et leur précision affecte directement la fiabilité des résultats expérimentaux. La correction (Calibration) est une étape clé pour assurer la stabilité des performances de l'appareil QPCR et nécessite une vérification et un ajustement systématiques réguliers du système de contrôle de la température (précision du contrôle de la température) et du système optique (détection du signal Fluorescent).
I. Objectifs fondamentaux de la correction
La correction du QPCR est conçue pour assurer la conformité des indicateurs de performance clés suivants:
Système de contrôle de la température: erreur d'indication de la température (écart de la température de consigne par rapport à la température réelle), uniformité de la température (différence de température entre les pores réactionnels), fluctuation de la température (variation de la température dans le temps), surpression maximale de la température (amplitude au - delà de la valeur de consigne pendant le processus de réchauffement / refroidissement), vitesse moyenne de refroidissement (vitesse de réchauffement / refroidissement).
Système optique: précision de l'intensité de fluorescence (cohérence du signal de fluorescence dans le même puits), nombre de cycles seuil (valeur CT), précision (cohérence des valeurs CT dans les différents puits), température de fusion (valeur TM), dérive (écart de température lorsque l'intensité de fluorescence diminue de moitié), coefficient de corrélation linéaire de fluorescence (relation linéaire de l'intensité de fluorescence à la concentration en acides nucléiques).
II. Préparation avant correction
1. Conditions environnementales
Température: 15 - 30 ℃ (éviter les fluctuations de température affectant les résultats d'étalonnage);
Humidité relative: 20 à 85% HR (protection contre l'humidité de l'instrument);
Alimentation: Stabilisez la tension (UPS recommandé), évitez les coupures de courant qui affectent le processus d'étalonnage.
2 Équipement et matériel
Substances de référence: l'utilisation de substances de référence validées (par exemple ADN plasmidique, substances de référence pour l'acide ribonucléique) est requise pour répondre aux exigences du JJF (Jin) 04 - 2020 en ce qui concerne les quantités caractéristiques (nombre de copies ≥ 10 ⁶ copies / μl) et l'incertitude relative de propagation (≤ 5%);
Équipement d'étalonnage: simulateur optique (capteur de température intégré avec générateur de lumière émise, plage de mesure de température 0 - 120 ℃, erreur maximale admissible ± 0,1 ℃; longueur d'onde de la lumière émise 360 - 780 nm, intensité relative du rayonnement lumineux réglable), Contrôleur de température multicanaux (par exemple, jdpc - 96 pour la mesure de la différence de température entre les pores réactifs);
Consommables: plaque d'étalonnage spéciale (par exemple, plaque d'étalonnage roi ab7500, plaque d'étalonnage de fond), pipette (2 μl, 10 μl, etc., sous réserve de vérification métrologique qualifiée), gants sans poudre (prévention de la contamination de la plaque d'étalonnage).
Iii. Principaux processus de correction
Le processus de correction du compteur QPCR doit suivre strictement les spécifications d'étalonnage du compteur PCR quantitatif à fluorescence en temps réel JJF (Jin) 04 - 2020, qui comprend principalement l'étalonnage du système de température et l'étalonnage du système optique en deux parties, les étapes spécifiques suivantes sont illustrées par l'exemple de l'instrument de la série ab7500:
(i) Calibration du système de température
La température est un paramètre central de la réaction QPCR et affecte directement l'efficacité de l'amplification de l'ADN. L'étalonnage du système de température nécessite l'utilisation d'un simulateur optique (tube de réaction de remplacement) qui simule les variations de température dans la réaction réelle et vérifie les performances de contrôle de la température de l'instrument.
1. Préparation avant l'étalonnage
Connecter le simulateur optique au QPCR, en veillant à ce que le capteur de température inférieur et la source lumineuse émettrice de fluorescence supérieure soient bien en contact avec le bloc homotherme de l'instrument;
Appliquer une huile thermiquement conductrice sous un simulateur optique, améliorant la conduction thermique;
Ouvrez le logiciel de l'instrument, sélectionnez le module "Calibration" et accédez au programme "Temperature Calibration".
2. Procédure d'étalonnage
Préchauffage: réglez la température de l'instrument à 23 ℃, exécutez le programme de préchauffage (environ 10 minutes) pour que l'instrument atteigne un état stable;
Réglage du point de température: sélectionnez 9 points de température (30 ℃, 50 ℃, 60 ℃, 70 ℃, 90 ℃, 95 ℃, etc.), chaque point de température dure 2 minutes (pour mesurer l'erreur d'indication de température, l'uniformité, la volatilité);
Processus de réchauffement / refroidissement: réchauffement de 50 ° C à 90 ° C (mesure du taux de réchauffement moyen), puis refroidissement de 90 ° C à 50 ° C (mesure du taux de refroidissement moyen);
Acquisition de données: l'instrument enregistre automatiquement la température de consigne (ts), la moyenne de température réelle (t₁), la valeur de fluctuation de température (t ₁), la valeur de dépassement maximale (t ₁) pour chaque point de température.
3. Calcul des résultats
Erreur d'indication de la température: △t = TS - t₁ (exigence ≤ ± 0,5 ℃);
Uniformité de la température: △ tu = T = Umax - t = UMIN (t = Umax est la température maximale de tous les pores et t = UMIN est la température minimale requise ≤ 1,0 ℃);
Fluctuation de la température: △ t △ v = ± (t △ Max - t △ min) / 2 (t △ Max est le maximum de la température d'un seul trou, t △ min est le minimum et nécessite ≤ 0,2 ℃);
Surcharge maximale de température: △ t os = tosmax - TS (tosmax est la valeur maximale de la surcharge de tous les trous et nécessite ≤ 3,0 ℃);
Vitesse moyenne de montée en température: v = (TB - ta) / tut (TB est la moyenne du point de température de 90 ℃, ta est la moyenne du point de température de 50 ℃, tut est le temps de montée en température, nécessite ≥ 4 ℃ / s);
Vitesse moyenne de refroidissement: v = down = (TB - ta) / tdo (tdo est le temps de refroidissement et nécessite ≥ 3 ° C / s).
Ii) calibrage du système optique
Les systèmes optiques sont responsables de la détection des signaux de fluorescence, dont la précision affecte directement les résultats quantitatifs de la valeur de CT par rapport à la concentration en acides nucléiques. L'étalonnage du système optique nécessite l'utilisation d'une plaque d'étalonnage spéciale (telle que la plaque d'étalonnage roi ab7500) qui ajuste la sensibilité du détecteur de fluorescence en fonction de la cohérence du signal.
1. Calibration de fond
Objectif: éliminer les interférences de la fluorescence de fond de l'instrument (par exemple, signal électronique, pollution par des consommables en plastique);
Étapes:
(1) Retirez la plaque d'étalonnage de fond (laissez - la à température ambiante pendant 5 minutes pour éviter la condensation);
(2) chargez la plaque d'étalonnage dans l'instrument et exécutez la procédure d '« étalonnage de fond» (environ 30 minutes);
(3) Le logiciel enregistre automatiquement le signal de fluorescence de fond, génère un fichier de correction de fond (déduit automatiquement dans les expériences ultérieures).
2. étalonnage roi (zone d'intérêt)
Objectif: cartographier les sites de pores sur la plaque réactionnelle avec le détecteur de l'instrument, en veillant à ce que le signal de fluorescence de chaque Pore soit acquis avec précision;
Étapes:
(1) Retirez la plaque d'étalonnage roi (plaque standard ou plaque rapide, il faut 5 secondes de vortex et centrifuger pendant 2 minutes);
(2) chargez la plaque d'étalonnage dans l'instrument et exécutez le programme « roi calibration»;
(3) Le logiciel prend automatiquement une image de chaque filtre, générant un masque de roi (un cercle vert est affiché autour de chaque trou, indiquant un étalonnage réussi);
(4) Si l'image est sursaturée (fluorescence intraporeuse trop forte), il est nécessaire d'ajuster le temps d'exposition (par exemple, de 2048 à 1024) pour récupérer l'image.
3. Calibration optique
Objectif: compenser les effets physiques du système optique (tels que la réponse spectrale du filtre), assurer la précision du signal de fluorescence;
Étapes:
(1) sélectionnez le programme "Calibration optique" pour charger le fichier d'étalonnage roi;
(2) exécutez le programme (environ 10 minutes), le logiciel analyse automatiquement les caractéristiques spectrales du signal de fluorescence, générant un fichier de correction optique.
4. Calibration des colorants
Objectif: vérifier la précision du signal de fluorescence de différents colorants (par exemple, fam, VIC, Rox), assurer la fiabilité des expériences Multi - colorants;
Étapes:
(1) Retirez la plaque d'étalonnage de colorant (contient de nombreux colorants fluorescents tels que Cy3, Cy5, fam, etc.);
(2) Charger la plaque d'étalonnage dans l'instrument pour exécuter la procédure d '« étalonnage des colorants»;
(3) Le logiciel acquiert automatiquement le spectre de fluorescence de chaque colorant, générant un fichier de correction de colorant (identification automatique du signal de colorant dans les expériences ultérieures).
Iii) Enregistrement des résultats et certificats
Une fois l'étalonnage terminé, un certificat d'étalonnage certifié CNAS contenant les éléments suivants est requis:
(1) Informations de base sur l'instrument (modèle, numéro de série, fabricant);
(2) calibrer les conditions environnementales (température, humidité, temps);
(3) Résultats d'étalonnage (erreur de valeur d'indication de température, uniformité, précision du système optique, etc.);
4° la signature de l’étalonneur et de l’auditeur;
(5) qualification de l'organisme d'étalonnage (numéro de reconnaissance CNAS).
Iv. Considérations relatives à la correction
1. Cycle d'étalonnage
Un étalonnage complet (conforme aux exigences JJF (Jin) 04 - 2020) est recommandé tous les 12 mois;
Elle peut être réduite à une fois par 6 mois à des fréquences d'utilisation élevées (par exemple, plus de 10 séances par jour) ou pour des applications critiques (par exemple, diagnostic clinique);
Après le déplacement, la réparation ou le remplacement des composants clés de l'instrument (p. ex., bloc chauffant, détecteur), il faut procéder à un recalibrage.
2. Support professionnel
L'étalonnage doit être effectué par l'Ingénieur du fabricant ou par un organisme tiers qualifié (par exemple, l'Institut municipal de métrologie et de surveillance des sciences de l'essai de Tianjin), garantissant la conformité aux SOP (procédures d'exploitation normalisées);
Il est interdit aux non - professionnels d'ajuster eux - mêmes les paramètres de l'instrument (p. ex. réglages de température, filtres optiques) afin de ne pas compromettre les résultats de l'étalonnage.
3. Vérification après étalonnage
Une fois l'étalonnage terminé, il est nécessaire d'exécuter une expérience de vérification de la substance étalon (par exemple, la substance étalon de l'ADN plasmidique) qui détecte la répétabilité de la valeur de CT (coefficient de variation ≤ 3%) par rapport au coefficient de corrélation linéaire (r² ≥ 0,99), ce qui garantit L'effet de l'étalonnage;
Si les résultats de la vérification ne sont pas conformes, vous devrez les recalibrer ou contacter le fabricant pour les réparations.
V. Questions fréquemment posées et résolution
1. L'uniformité de la température ne répond pas aux exigences
Causes: contamination des blocs homothermes (p. ex. produits PCR résiduels), vieillissement des capteurs de température;
Solution: nettoyer le bloc homotherme (essuyer avec de l'éthanol anhydre), remplacer le capteur de température.
2. Faible intensité du signal fluorescent
Causes: Échec de l'étalonnage roi (mauvaise cartographie des puits), fluorescence de fond trop élevée;
Solution: refaire l'étalonnage roi, exécuter l'étalonnage de fond (remplacer la plaque d'étalonnage de fond).
3. Grande variation de la valeur de CT
Causes: fluctuations de température excessives (par exemple, instabilité du bloc chauffant), diminution de la sensibilité du détecteur de fluorescence;
Solution: vérifiez la stabilité de la température du bloc chauffant (mesurée avec un contrôleur de température multicanal), Remplacez le détecteur de fluorescence.
Vi. Résumé
La correction du PCR quantitatif à fluorescence est une étape clé pour garantir que les données expérimentales sont précises et fiables, et il est nécessaire de suivre strictement les normes de l'industrie (telles que jjf1527 - 2015, JJF (Jin) 04 - 2020) pour calibrer régulièrement le système de contrôle de la température et le système optique. Lors de l'étalonnage, il est nécessaire de prêter attention aux conditions environnementales, au soutien professionnel et à la vérification des résultats, afin de s'assurer que les performances de l'instrument sont conformes aux exigences expérimentales. Grâce à un processus de correction normalisé, vous pouvez réduire efficacement les erreurs expérimentales et améliorer la précision et la répétabilité des résultats QPCR.