Mythe 1: plus il y a de canaux d'instruments, mieux c'est

Avec l'utilisation mature de la technologie PCR, l'amplification multiple est de plus en plus animée et les PCR quantitatives à fluorescence ne sont pas épargnées. Du développement du PCR quantitatif fluorescent à canal unique lancé par la société zui initial ABI jusqu'à ce que divers fabricants lancent aujourd'hui des PCR quantitatifs fluorescents à 4, 5 et même 6 canaux, le choix éblouissant ne suffit pas, quelqu'un est entré accidentellement dans le mythe de "plus de canaux, mieux c'est".

Lors de l'utilisation des fluorimètres à 5 canaux de certains fabricants, afin de garantir la validité et la précision des résultats expérimentaux, Rox (un colorant Fluorescent) ou Reference Dye doit être utilisé dans l'expérience, ces colorants fluorescents doivent utiliser un canal de détection distinct. De cette façon, il n'y a que quatre voies efficaces pour détecter les signaux de Fluorescence PCR multiples, et l'utilisation de colorants correcteurs peut augmenter les coûts d'utilisation plus tard. Certains canaux de détection de PCR quantitative fluorescente sont ouverts uniquement pour les colorants fluorescents ou les réactifs de leurs propres fabricants, et les canaux de détection efficaces ne sont pas aussi nombreux que ceux annoncés dans la publicité. Il est particulièrement important de confirmer le canal de détection efficace de l'instrument PCR quantitatif Fluorescent avant l'achat et ne peut pas simplement écouter la publicité. Lorsque l'on considère le nombre de canaux pour la PCR quantitative par fluorescence multiple, il convient également de partir de la réalité du laboratoire, où la PCR multiple n'est pas applicable et accessible à tous, car elle complique les expériences.

Erreur deux: aucune fonction de gradient requise pour le PCR Real - time

Pour les réactions quantitatives de PCR utilisant la méthode de colorant, bien qu'il existe une variété de logiciels de conception d'amorces PCR ou de formules empiriques pour calculer la température de fusion (valeur de TM), la formule utilisée est différente, la séquence d'amorces est différente et la valeur de TM varie considérablement. La température de fusion des amorces détermine la température de recuit. Et la combinaison de bases dans le moule est très variable, pour les pièces spéciales, les données obtenues par la formule empirique ne peuvent pas nécessairement donner des résultats précis, les différences subtiles de température de recuit peuvent avoir un impact décisif sur les résultats, de sorte que les « conditions de toucher» sont à un moment donné un problème de maux de tête. L'apparition de la PCR à gradient résout en partie certains problèmes - les conditions de contrôle de la température de chaque puits au cours de la réaction peuvent varier dans la gamme en fonction du gradient et, en fonction des résultats, les conditions de réaction peuvent être explorées en une seule étape.

Même la température de dénaturation et la température d'élongation peuvent être optimisées sans la seule température de recuit, ce qui est important pour la plupart des enzymes Taq haute fidélité amplifiées par de nombreuses polymérases hybrides telles que Invitrogen, clontech, promega, car les températures de réaction * de Taq et de l'enzyme corrigée peuvent varier considérablement et il est important d'optimiser la température d'élongation.

L'utilisation de la PCR quantitative par fluorescence avec fonction Gradient peut compléter le processus d'optimisation de plusieurs expériences précédentes à la fois, ce qui simplifie les expériences fastidieuses dans les conditions de réaction de PCR à tâtons, économisant à la fois le temps d'expérimentation et le coût de l'expérience.