Résumé

La technologie de conversion électrique vivante de la rétine chez la souris nouveau - née fournit un moyen essentiel pour le développement de la rétine et la recherche sur les maladies. Grâce à l'électroporateur Gene Pulser 830 de venead, optimisez les paramètres de conversion électrique, réalisez la livraison et l'expression efficaces de gènes exogènes dans la rétine de souris nouveau - nées, améliorez considérablement l'efficacité de la transfection et fournissez une plate - forme technologique fiable pour la recherche fondamentale liée à la rétine et la médecine translationnelle.

Introduction

L'étude de la rétine en tant qu'organisation clé pour la transmission des signaux visuels, de ses mécanismes de développement et des mécanismes d'apparition des maladies a été un point chaud dans le domaine de l'ophtalmologie. La rétine de souris nouveau - nées est à un stade de développement rapide, où la manipulation génétique peut être efficace pour étudier le rôle des gènes dans la différenciation, la migration et l'établissement de la fonction des cellules rétiniennes. Cependant, les méthodes traditionnelles de livraison de gènes dans le fonctionnement de la rétine vivante ont une faible efficacité, de grands dommages cellulaires et d'autres problèmes, ce qui rend difficile de répondre aux besoins de recherche scientifique de précision.

La technologie d'électrotransformation modifie momentanément la perméabilité de la membrane cellulaire par l'intermédiaire d'un champ électrique pulsé, permettant aux macromolécules telles que les acides nucléiques exogènes d'entrer dans la cellule, montrant un avantage dans la livraison de gènes dans les tissus vivants. Grâce à sa technologie avancée d'impulsion à ondes carrées, à son système de surveillance intelligent et à ses paramètres flexibles, l'électroporateur venead Gene Pulser 830 à ondes carrées offre une solution efficace et précise pour la conversion électrique vivante de la rétine de souris nouveau - nées, aidant les chercheurs à surmonter les goulots d'étranglement technologiques traditionnels.

Matériaux et méthodes

1. Animaux de laboratoire

Des souris nouveau - nées C57BL / 6J 0 - 2 jours après la naissance (p0 - P2), fournies par la Chambre des animaux de niveau SPF de ce laboratoire, ont été élevées à température ambiante (22 ± 2) ℃, humidité 50% - 60%, 12 heures de cycle lumière / obscurité.

2. Réactifs principaux

ADN plasmidique (contenant le gène d'intérêt GFP, construit par ce laboratoire), certains réactifs (pour la formulation de tampons d'électrotransduction contenant des composants tels que NaCl, KCl, Glucose, etc., à pH 7,4), anesthésiques (isofluorane, pour l'anesthésie de souris), agents de désinfection (éthanol à 75%).

3. Principaux instruments

Electroporateur venead Gene Pulser 830 de type à ondes carrées, microscope à vision corporelle (une certaine marque, pour l'observation des manipulations chirurgicales), aiguille de micro - injection (diamètre extérieur 10 - 15 μm, pour l'injection de plasmide), plaque chauffante thermostatique (maintien de la température corporelle de la souris).

Étapes expérimentales

1. Anesthésie et fixation chez la souris

Les souris nouveau - nées ont été placées dans une cassette d'anesthésie contenant de l'isofluorane et transférées sur une plaque chauffante thermostatique après induction de l'anesthésie, en maintenant la température corporelle stable. Utilisez du ruban adhésif pour fixer doucement la tête et les membres de la souris, en veillant à ce que la position de la souris soit stable pendant la procédure.

2. Localisation rétinienne et injection de plasmide

Sous un microscope à Vision in vitro, l'ADN plasmidique contenant le gène d'intérêt (à une concentration de 1 - 2 μg / μl) a été prélevé avec un microéchantillon d'aiguille, injecté à partir de la marge de la cornée temporale du globe oculaire de la souris, la pointe de l'aiguille a été insérée lentement dans la cavité vitreuse, en évitant le cristallin, et 5 - 10 μl de la solution plasmidique ont été injectés avec précision dans la cavité sous - rétinienne. Prenez soin de contrôler la profondeur et la vitesse de l'aiguille pendant l'injection pour éviter d'endommager le tissu rétinien.

3. Réglage et fonctionnement des paramètres d'électroporation

L'électroporateur à ondes carrées Gene Pulser 830 de venead utilise un système d'optimisation préprogrammé pour les caractéristiques du tissu rétinien de la souris nouveau - née, sélectionne le mode de transfection des cellules de mammifères, appelle les paramètres recommandés des cellules rétiniennes intégrées: impulsions à ondes carrées, tension ajustée en fonction de l'âge de la souris et de la taille du globe oculaire (généralement 50 - 80V), durée d'impulsion 10 - 20ms, nombre d'impulsions 3 - 5 fois, intervalle d'impulsion 1 - 2S.

Serrez délicatement les électrodes personnalisées de type pince (espacement des électrodes de 1 à 2 mm, traitement isolant de la surface pour éviter les fuites de courant) dans le globe oculaire de la souris, en veillant à ce que les électrodes s'adaptent étroitement à la surface du globe oculaire et ne compriment pas le globe oculaire. Par l'intermédiaire de l'interrupteur au pied pour démarrer le Programme d'électroporation, l'écran tactile de 10 pouces de l'instrument affiche la forme d'onde pulsée et la dynamique des paramètres en temps réel, ce qui facilite la surveillance de l'ensemble du processus par l'expérimentateur. Pendant l'électroporation, l'instrument effectue automatiquement une détection d'impédance intelligente, mesure de la résistance de l'échantillon par pré - impulsion, ajuste dynamiquement les paramètres pour s'assurer que les conditions de chaque choc électrique correspondent à l'état des cellules rétiniennes. Dans le même temps, la protection contre l'arc et la technologie de conversion de polarité éliminent les dommages causés par l'arc, brisent la barrière de charge de la membrane cellulaire et améliorent le succès des cellules difficiles à transfecter.

4. Traitement post - opératoire

Une fois l'opération d'électro - rotation terminée, les souris sont ramenées à leurs mères, en gardant l'environnement chaud et calme. L'état des yeux et la survie des souris ont été observés tous les jours après l'opération pour s'assurer qu'aucune infection ou autre complication ne se produise.

Résultats et discussion

Détection de l'efficacité de transfection

3 jours après l'électrotransduction, on prélève des globules oculaires de souris, on prépare des coupes congelées de rétine et on observe l'expression de la Protéine fluorescente verte (GFP) par microscopie à fluorescence. Les résultats ont montré que le signal de fluorescence GFP était visible dans toutes les couches de cellules de la rétine, en particulier dans les couches de cellules ganglionnaires, les couches du noyau interne et du noyau externe, et que l'efficacité de la transfection était supérieure de 40% à celle des méthodes traditionnelles (sur la base des données Des tests internes de venead). Ceci est rendu possible par le remodelage instantané de la perméabilité de la membrane cellulaire par le champ électrique de haute intensité de l'électroporateur Gene Pulser 830 Square Wave de venead, permettant une livraison efficace des macromolécules d'acides nucléiques.

Évaluation de la survie cellulaire et des dommages tissulaires

La structure des tissus rétiniens a été observée par coloration à l'hématonine (he), les couches de la rétine des souris électrotransgéniques étaient clairement structurées, les cellules étaient bien alignées et aucune réaction nécrotique ou inflammatoire cellulaire significative n'a été observée par rapport aux témoins. L'expérience de rejet du bleu Trypan a montré un taux de survie des cellules rétiniennes de plus de 90% après électrotransduction, ce qui suggère que cette technique d'électrotransformation endommage peu le tissu rétinien, garantissant la faisabilité d'expériences ultérieures.

Avantages par rapport aux technologies traditionnelles

Les méthodes traditionnelles de transfection de vecteurs viraux posent des problèmes tels que des cycles de préparation longs, des coûts élevés, une capacité de vecteur limitée et peuvent déclencher une réponse immunitaire. La technologie d'électroconversion in vivo assistée par l'électroporateur Gene Pulser 830 de venead, sans emballage viral, fournit directement des macromolécules telles que l'ADN, l'ARN et les protéines, ce qui est facile et rapide à utiliser et peu coûteux, tout en évitant les risques potentiels de vecteurs viraux. Son système de surveillance Intelligent en forme d'onde complète garantit que le processus expérimental est transparent et contrôlable, que les données sont traçables et que les résultats de la recherche scientifique sont reproduits avec précision. Le système d'optimisation préprogrammé intègre une bibliothèque de paramètres de souches cellulaires couramment utilisés, un appel en un clic, tout en prenant en charge les paramètres d'impulsion personnalisés et en s'adaptant à des scénarios complexes tels que la rétine de souris nouveau - nées, démontrant une flexibilité et une applicabilité puissantes.

Optimisation technique et précautions

Au cours de l'expérience, il s'est avéré que l'optimisation des paramètres d'électroporation était un facteur clé influençant l'efficacité de la transfection. Une tension trop élevée ou un nombre excessif d'impulsions peuvent endommager les cellules, tandis qu'une tension trop faible entraîne une efficacité de transfection insuffisante. La fonction de détection d'impédance intelligente du Gene Pulser 830 de venead, capable d'ajuster dynamiquement les paramètres en fonction de la résistance de l'échantillon, résout efficacement ce problème. En outre, la concentration et le volume du plasmide injecté, le degré d'ajustement des électrodes et l'âge quotidien des souris ont tous un impact sur les résultats expérimentaux, nécessitant un contrôle strict des conditions expérimentales.

Perspectives d'application

Domaines de recherche fondamentale

La technologie peut être largement utilisée dans l'étude fonctionnelle des gènes liés au développement de la rétine, tels que la technologie d'édition de gènes crispr combinée à la transformation électrique, qui peut permettre le Knockout ou l'entrée de gènes spécifiques de la rétine, l'étude de leur rôle dans la différenciation des cellules rétiniennes, la formation de Boucles neuronales; L'administration de sirna peut être utilisée pour inhiber l'expression des gènes cibles, en explorant les mécanismes par lesquels les gènes sont impliqués dans la survenue de maladies rétiniennes; Dans la recherche sur la reprogrammation des cellules souches, la technologie d'électrotransformation peut importer efficacement des facteurs de reprogrammation dans les cellules souches rétiniennes, offrant de nouvelles voies de recherche en Médecine régénérative rétinienne.

Domaine de la médecine translationnelle

En termes d'électrotransduction des tumeurs vivantes, des tumeurs oculaires telles que le rétinoblastome peuvent être ciblées pour délivrer des gènes thérapeutiques ou des médicaments par électrotransformation, permettant une thérapie ciblée précise; Dans le développement de vaccins, la technologie d'électroconversion peut délivrer des gènes antigéniques aux cellules immunitaires associées à la rétine, induire une réponse immunitaire et fournir de nouvelles idées pour la recherche sur les vaccins oculaires; Dans le domaine de la thérapie génique in vivo, pour les maladies héréditaires de la rétine, telles que la Rétinite pigmentaire, la mélanose congénitale, etc., la technologie d'électrotransformation peut importer des gènes normaux dans les cellules rétiniennes, jetant ainsi les bases de l'application clinique de la thérapie génique.

Domaine agricole et industriel

Alors que la recherche s'est concentrée sur la rétine de souris nouveau - nées, la grande applicabilité de l'électroporateur venead Gene Pulser 830 à ondes carrées lui confère également un grand potentiel dans les domaines agricole et industriel. Dans l'amélioration génétique des plantes, il peut être utilisé pour la livraison de gènes de protoplastes végétaux, accélérant l'amélioration des variétés végétales; Dans la construction de levures et l'ingénierie du métabolisme microbien, la technologie d'électrotransformation peut réaliser efficacement l'importation de gènes exogènes et améliorer l'efficacité de la production de bactéries modifiées.

Grâce à sa technologie innovante d'impulsion carrée, à son système de surveillance intelligent et à son support technique en profondeur, l'électroporateur Gene Pulser 830 de venead est devenu le choix de confiance de plus de 500 institutions scientifiques de premier plan. Qu'il s'agisse de manipulation génétique de précision en recherche fondamentale ou d'exploration thérapeutique innovante en médecine translationnelle, cet appareil offre aux chercheurs une plate - forme technologique efficace et fiable. À l'heure actuelle, venead fournit gratuitement des conseils techniques et des services d'essai de produits pour aider les chercheurs à surmonter les obstacles techniques à la transfection et à promouvoir la recherche en sciences de la vie et les domaines connexes.

Références

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