◆ 1 - Échantillonnage de micro - organismes: comme de nombreux micro - organismes sont reproductibles sur des plaques d'agar, la première étape consiste à trouver les bonnes conditions de culture. L'utilisation de la technique simple et commune de culture des cellules sur des plaques d'agar permet une préparation pratique des échantillons. Par exemple, les bactéries sont cultivées d'abord dans des quadrants de différentes densités cellulaires sur des plaques d'agar pendant 16 à 24 heures, ce qui donne des résultats très fiables. Les colonies ne sont récoltées que dans le troisième quadrant. L'étude a révélé que la clé du succès de la méthode réside dans la normalisation des conditions de collecte et la cohérence de la croissance bactérienne sur les plaques d'agar. Certaines améliorations peuvent également être apportées (par exemple, le passage à un milieu liquide ou la modification du temps de culture / de la température). Il faut toutefois s'assurer que toutes les mesures sont effectuées dans les mêmes conditions pour obtenir des résultats fiables.

◆ 2 - techniques de mesure bactériologique: les techniques utilisées pour l'identification microbiologique doivent être simples et très reproductibles. Lorsque la solution microbienne sèche lentement, les cellules microbiennes produisent un biofilm solide. En optimisant ce processus, on obtient une procédure de préparation d'échantillon facile à utiliser et qui répond à la reproductibilité requise pour les mesures infrarouges. La lumière infrarouge pénètre dans le biofilm et est partiellement absorbée par les différentes molécules présentes dans la cellule, produisant une empreinte chimique unique à chaque souche testée.

Pour l'identification microbienne FT - IR, notre principale préoccupation est la précision des résultats, dont la clé dépend de la qualité de la Banque de spectres de référence. Les banques spectrales de micro - organismes sont différentes des banques spectrales générales et, pour garantir la fiabilité des résultats, il est nécessaire d'établir des banques spectrales systématiques dans des conditions normalisées.

Tout d'abord, il est nécessaire d'assurer une culture reproductible des micro - organismes. Le milieu de culture, les conditions de culture (telles que le temps, la température) et le prétraitement de l'échantillon ont tous un impact sur le spectre infrarouge, de sorte que ces conditions nécessitent la production de protocoles opérationnels normalisés.

Deuxièmement, l'hétérogénéité et la variabilité au cours du prétraitement de l'échantillon (par exemple, la taille de l'échantillon, le degré de séchage du mycélium, etc.) et les facteurs mesurés (par exemple, la diffusion de la lumière causée par la présence de particules dans l'échantillon, etc.) peuvent tous influencer le spectrogramme infrarouge. Plusieurs mesures sur un même échantillon sont donc nécessaires pour assurer la reproductibilité du spectrogramme infrarouge.

Troisièmement, la crédibilité des échantillons inconnus pour lesquels une identification infrarouge a été effectuée repose sur la fiabilité de la Banque spectrale du spectre de référence. La souche de référence doit donc être identifiée par une méthode fiable. Sinon, des informations incorrectes dans la Banque de spectres peuvent entraîner des écarts dans les résultats finaux de qualification. La combinaison de plusieurs régions spectrales remarquables permet de construire une base de données de souches bactériennes connues. Pour classer et identifier les bactéries inconnues, les informations spectrales sont comparées à une base de données de référence de bactéries connues, montrant les microorganismes dont les profils spectraux correspondent à des souches inconnues. La similitude des différents spectres microbiens peut également être décrite graphiquement sous la forme d'un dendrogramme.