Colonne de chromatographie liquide

Colonne de chromatographie liquide

Le système d'un chromatographe en phase liquide se compose de plusieurs parties telles qu'un réservoir, une pompe, un échantillonneur, une colonne de chromatographie, un détecteur, un enregistreur, etc. La phase mobile dans le réservoir est entraînée dans le système par la pompe à haute pression, la solution d'échantillon est entrée dans la phase mobile par l'intermédiaire de l'échantillonneur, chargée par la phase mobile à l'intérieur de la colonne de chromatographie (phase stationnaire), en raison du fait que les composants de la solution d'échantillon ont des coefficients de partage différents dans les deux phases, lorsque le mouvement relatif est effectué dans les deux phases, après un processus de distribution répété et répété d'adsorption - désorption, chaque composant crée une grande différence dans la vitesse de déplacement, est séparé en un seul composant sortant de la colonne à son tour, à travers Le détecteur, la concentration de l'échantillon est convertie en un signal électrique transféré à l'enregistreur et les données sont imprimées sous forme

Structure du principe

[1] structure de la colonne de chromatographie liquide:

a 、 La colonne vide est Assemblée par le joint de colonne, le tube de colonne et le filtre

Le joint de colonne adopte une structure à faible volume mort, le joint de colonne est un assemblage fileté à deux extrémités, une extrémité est un filetage interne de 7 / 16 pouce et l'autre extrémité est un filetage interne de 3 / 16 pouce (normalisé à la maison et à l'étranger). Le filetage intérieur de 7 / 16 "est relié à un tube de colonne de 1 / 4" (Φ6.35mm) avec un anneau de pression placé au milieu pour l'étanchéité. Un filetage interne de 3 / 16 pouce est connecté à un tube de raccordement de 1 / 16 pouce (Φ 1,57 mm), avec un anneau de pression placé au Centre pour l'étanchéité des joints de colonne. Afin de minimiser le volume mort à l'extérieur de la colonne, lors de l'installation de la colonne de chromatographie, utilisez le tube de connexion Φ 1,57 mm pour presser la bague à travers la vis creuse après avoir essayé de la brancher, puis serrer la vis creuse. La bague de compression est serrée sur le tube de connexion après la déformation de l'extrusion par des vis creuses (la longueur du tube de connexion révélé après le passage de la bague de compression doit être strictement contrôlée à 2. 5 mm de longueur ou d'autres dimensions fixes).

À l'intérieur du joint de colonne à deux extrémités, une feuille de filtre en acier inoxydable (ou maille) est placée à chaque extrémité du tube de colonne pour obturer le remplissage de la colonne sans être perdue par la phase mobile sortant de la colonne. Chaque composant de la colonne vide est en acier inoxydable 316L, peut résister à l'action générale du solvant. Mais parce que les solvants contenant du chlorure sont corrosifs pour eux, il est important de noter lors de l'utilisation que ces solvants ne peuvent pas rester longtemps dans la colonne et le tube de connexion pour éviter la corrosion.

b 、 Remplissage de colonne:

L'action de séparation des colonnes de chromatographie liquide est réalisée entre la charge et la phase mobile, la classification des colonnes étant fonction du type de charge. Colonne de phase normale: plus de gel de silice comme remplissage de colonne. Selon le profil, il peut être divisé en non - conformation et sphérique, dont le diamètre des particules est compris entre 3 et 10 μm. Une autre catégorie de charges en phase normale est le gel de silice lié en surface - cn, - NH2 et d'autres groupes fonctionnels appelés gel de silice lié. Colonne inverse: principalement en gel de silice comme matrice, à la surface de laquelle est fixée une charge apolaire à fonction octadécyle (ODS). Il existe également des fractions non stéréotypées et de type balle.

D'autres charges inverses couramment utilisées sont les liaisons C8, C4, C2, phényle, etc., dont la taille des particules est comprise entre 3 et 10 µm. Exigences pour les agents de remplissage

L'agent de remplissage de colonne chromatographique couramment utilisé est un gel de silice lié chimiquement. Les systèmes de chromatographie en phase inverse utilisent des agents de charge apolaires couramment utilisés pour les gels de silice liés à l'octadécylsilane, les gels de silice liés à l'octylsilane et d'autres types de gels de silice liés au SILANE tels que les Silanes liés au cyano et les Silanes liés à l'Amino, etc. Le système de chromatographie en phase positive utilise des agents de remplissage polaires, les agents de remplissage couramment utilisés sont le gel de silice, etc. Le système de chromatographie échangeuse d'ions utilise un agent de charge échangeur d'ions; Les systèmes de chromatographie d'exclusion moléculaire utilisent des agents de charge tels que des gels ou des microsphères poreuses macromoléculaires; La séparation des énantiomères utilise généralement des agents de remplissage chiraux.

Les propriétés de l'agent de charge (telles que la forme du support, la taille des particules, le diamètre des pores, la surface, la couverture superficielle des groupes de liaison, la teneur en carbone et le type de liaison, etc.) ainsi que le remplissage de la colonne de chromatographie influencent directement le comportement de rétention et L'effet de séparation de l'échantillon. Les charges dont le diamètre des pores est inférieur à 15 nm (1 nm = 10 Å) conviennent pour l'analyse des composés de poids moléculaire inférieur à 2000, et les charges dont le diamètre des pores est supérieur à 30 nm doivent être choisies pour les composés de poids moléculaire supérieur à 2000. Sauf indication contraire, la taille des particules de remplissage de la colonne d'analyse est généralement

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Entre 3μm ~ 10μm. Des agents de remplissage de plus petite taille de particules (de l'ordre de 2 µm) sont fréquemment utilisés pour le remplissage de colonnes à microdiamètres (de l'ordre de 2 mm de diamètre intérieur) auxquelles doivent correspondre les performances de la pompe à perfusion, le volume de l'échantillon, le volume de la cellule de détection et Le volume mort du système, etc., lors de l'utilisation de colonnes à microdiamètres; Si nécessaire, les conditions chromatographiques doivent également être adaptées de manière appropriée. En cas de litige concernant les résultats de leur détermination, les résultats de la détermination des conditions chromatographiques spécifiées dans le corps de la variété prévalent.

Exigences de température

La température d'utilisation de la phase fixe ordinaire collée sur support de gel de silice ne dépasse généralement pas 35°c, la température d'utilisation de la colonne de chromatographie peut être convenablement augmentée pour améliorer l'effet de séparation, mais ne peut dépasser 60°C.

Exigences de la phase mobile

Le pH de la phase mobile doit être contrôlé entre 2 et 8. Lorsque le pH est supérieur à 8, le gel de silice support peut être solubilisé; Lorsque le pH est inférieur à 2, la phase de liaison chimique liée au gel de silice est susceptible de tomber par hydrolyse. Lorsqu'une phase mobile de pH supérieur à 8 doit être utilisée dans le système de chromatographie, il convient de choisir des agents de charge résistants aux alcalis, tels que des agents de charge de gel de silice lié utilisant un gel de silice de haute pureté comme support et présentant une couverture de surface élevée, des agents de charge polymériques enrobés, des agents de charge hybrides organiques - inorganiques ou des agents de charge non siliconés, etc.; Lorsque l'on souhaite utiliser une phase mobile dont le pH est inférieur à 2, il convient de choisir des agents de charge résistants aux acides, tels que des agents de charge en gel de silice lié à l'octadécylsilane substitué diisopropyle ou diisobutyle ayant une chaîne latérale volumineuse capable de produire une protection stérique bloquante, ou des agents de charge hybrides organiques - inorganiques, etc.

Précautions

Effet de colonne et colonne de protection pour colonne chromatographique

Lors de l'obtention d'une nouvelle colonne, assurez - vous de regarder d'abord les instructions pour le faire, puis mesurer l'effet de la colonne, détecter régulièrement l'effet de la colonne, conserver le chromatogramme obtenu sur la nouvelle colonne chromatographique et enregistrer les conditions, détecter régulièrement l'élargissement de la bande spectrale de l'instrument. S'il est appliqué à la surveillance en ligne, la colonne de chromatographie doit fournir une protection physique et chimique en ligne, par exemple en installant des filtres en ligne, des colonnes de protection auto - chargées et des colonnes de protection préinstallées. Le rôle du filtre en ligne est d'empêcher l'accumulation de particules dans la tête de colonne, l'avantage est qu'il n'affecte pas fondamentalement l'effet de colonne, couramment utilisé lorsque l'effet de colonne élevé est nécessaire, les consommables souvent remplacés sont la cartouche filtrante et le rôle de la colonne de protection de la rondelle est d'empêcher la colonne d'être contaminée chimiquement. L'inconvénient est que la plupart des colonnes de protection affectent l'efficacité de la colonne de chromatographie, en particulier lors de l'utilisation de microcolonnes, les colonnes de protection avec des charges auto - chargées ordinaires sont couramment utilisées. Près de nouvelles colonnes de protection telles que s e n t r Y - G u a r d colonne de protection, il se caractérise par une haute qualité, un remplissage efficace, une augmentation de l'effet de la colonne d'analyse, une grande capacité de charge pour les échantillons sales, peut prolonger la durée de vie de La colonne de protection, les joints peuvent être serrés à la main, pas besoin d'outils lors de l'installation, gain de temps, conception de noyau remplaçable, peut utiliser une variété de remplissages différents, principalement pour les échantillons très sales et très complexes, tels que les échantillons biochimiques, les échantillons environnementaux et les aliments, etc., ou ne veulent pas faire trop d'extraction en phase de pépinière, ne veulent pas réduire l'effet de la colonne et d'autres situations.

Nettoyage de la colonne chromatographique

Avoir une bonne connaissance de l'échantillon fait, nettoyer avec une phase mobile forte sur la capacité d'élution de cet échantillon Zui, pour la colonne de gel de silice, d'abord avec du méthanol pour éliminer les impuretés polaires, puis avec du dichlorométhane sec et du N - heptane 1 0 - 2 0 o r al activé séquentiellement, pour la liaison et la colonne de phase, généralement avec du méthanol monométhanol un rinçage séquentiel à l'eau, chaque colonne chromatographique a une méthode de nettoyage spécifique, assurez - vous de voir ses instructions d'utilisation

Dépôt de colonnes chromatographiques

Enlever les impuretés et le sel avant le stockage, appliquer un solvant de stockage approprié, éviter le dessèchement du lit de la colonne de chromatographie, éviter les vibrations mécaniques, empêcher la croissance bactérienne, faire attention à la température de stockage.

Dépannage

1, pression de colonne trop élevée

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Peut - être un blocage de particules. Le lit de colonne est gonflé, l'adsorption irréversible, la croissance bactérienne, etc. Il peut également y avoir des problèmes de contre - pression du système, tels que des amortisseurs bloqués, des échantillonneurs bloqués, des lignes ou des orifices de connexion bloqués. Les filtres en ligne ne sont pas propres, les capteurs de pression ne sont pas précis, etc.

2, faible effet de colonne

Il peut s'agir d'une contamination de la colonne de chromatographie, d'un colmatage partiel de la feuille filtrante, d'un volume mort à l'intérieur de la colonne de chromatographie, par example d'une valeur P H de phase mobile, ou d'une perte de phase stationnaire due à une composition inadaptée. Les changements brusques dans la phase mobile causent des dommages physiques à la phase fixe, les vibrations mécaniques provoquent des fissures dans la phase fixe et le lit de la colonne se rétrécit ou se dessèche.

Il est également possible que ce soit le problème de la connexion de l'instrument, vérifiez sérieusement si l'échantillonneur, le détecteur, la ligne, la colonne de protection et le filtre en ligne, etc. sont bien connectés, ou peut - être que la colonne de chromatographie n'est pas bien équilibrée, la quantité excessive d'échantillon est un problème.

3, mauvaise répétabilité, pas de pic, faible taux de récupération

Il peut s'agir d'une colonne de chromatographie contaminée, d'une phase mobile de valeur P H ou d'une composition inadaptée entraînant une perte de phase stationnaire, d'un solvant différent de l'échantillon ou de l'échantillon lui - même instable, d'une phase stationnaire trop polaire ou d'une phase mobile trop faiblement polaire. Ou une Adsorption non spécifique se produit. Il est également possible que le temps d'équilibre lors de l'expérience de gradient soit insuffisant, que la température fluctue, que la composition de la phase mobile change, que le solvant de l'échantillon soit différent, que la stabilité de l'échantillon ne soit pas bonne, que la méthode ne soit pas bien développée, que l'acidité et l'alcalinité du tampon soient inappropriées ou que la capacité tampon soit insuffisante.

Jusqu'à ce qu'il n'y ait pas de bulles dans la ligne (de la bouteille de solvant à l'entrée de la pompe), le canal de commutation continue à purger jusqu'à ce que tous les canaux à utiliser soient exempts de bulles.

10, cliquez sur l'icône Pump, le menu paramètres apparaît, cliquez sur l'option Pump Control, cochez off, cliquez sur OK pour éteindre la pompe, fermez pure valve.

Cliquez sur l'icône Pump, le menu paramètres apparaît, cliquez sur l'option Setup Pump, entrez dans l'écran d'édition Pump, laissez Flow: 1,0 ml / min.

12, cliquez sur l'icône du flacon sous la pompe, comme le montre l'image (prenez la pompe binaire comme exemple), entrez le volume réel du solvant et le volume du flacon. Le volume de la pompe d'arrêt peut également être entré. Cliquez sur OK