Agents biologiques

Un,Kits de détection de mycoplasmesCaractéristiques du produit:

(1) seulement 1 μl de surnageant de cellules de culture et 1 pot de bain - Marie, aucun besoin d'extraire l'ADN génomique, aucun besoin de microscope à fluorescence, PCR, électrophorèse, imageur de gel, détecteur de Bioluminescence et d'autres équipements expérimentaux complexes;

(2) seulement 1h résultats, méthode simple et rapide de détection de mycoplasme cellulaire;

(3) une seule opération d'étape pour compléter l'expérience entière, le résultat de l'expérience est intuitivement et facilement discernable à l'œil nu en fonction du changement de couleur du liquide réactif, sans électrophorèse, pour éviter le risque de faux positifs présentés par l'ouverture du couvercle en plusieurs étapes;

(4) la sensibilité est bien supérieure à celle de la méthode PCR et permet la détection de nombreux mycoplasmes communs en culture cellulaire (Mycoplasma Nasalis porcin, Mycoplasma Jing - Amino, Mycoplasma oral, Mycoplasma acellulosis, Mycoplasma fermentum, Mycoplasma salivaire, Mycoplasma Humanoïde, Mycoplasma Poirier, représentant 98% de la contamination par Mycoplasma).

Deux,Kits de détection de mycoplasmesComposition (25T):

Iii. Étapes expérimentales:

(1) Préparation du surnettoyage du liquide de culture cellulaire à tester

Les cellules à tester sont cultivées pendant 2 - 3 jours et le taux de fusion est de préférence supérieur à 80% en prenant un volume supérieur à 200 µl de solution de culture cellulaire, centrifuger à 200 g pendant 5 minutes, puis prendre le surnageant pour la détection ultérieure (ne pas prendre 50 µl de solution de culture et de précipitation cellulaire au fond du tube est suffisant);

(2) Formulation du système réactionnel (d'abord mettre la solution a, la solution B, le contrôle positif, l'huile de paraffine immédiatement après la décongélation et la fonte sur la glace)

Retirer la solution a de - 20°C et laisser décongeler et fondre, mélanger doucement à l'envers de haut en bas. Formuler le système réactionnel suivant dans un tube de microcentrifugation en fonction du nombre d'échantillons cellulaires à tester (il est très important que le processus de formulation du système réactionnel soit effectué sur glace);

Remarque: Chaque expérience nécessite 1 contrôle négatif, 1 contrôle positif et, en raison de l'erreur de pipetage de la pipette, la détection de n échantillons est généralement recommandée pour formuler n + 3 des systèmes réactionnels ci - dessus.

Malaxer délicatement à l'aide d'un oscillateur, puis fractionner dans des tubes PCR (tube PCR de volume 200 µl recommandé), chaque tube étant fractionné avec 24 µl du liquide réactionnel malaxé ci - dessus;

(3) Échantillonnage supérieur (il est très important que tout le processus d'échantillonnage supérieur reste effectué sur glace, en particulier l'huile de paraffine recouverte au - dessus du liquide réactionnel nécessite un pré - refroidissement sur glace)

Échantillon à tester: ajouter 1 µl de surnageant après centrifugation à tester dans le tube réactionnel, puis souffler doucement 5 fois avec ce pistolet d'addition de liquide de haut en bas;

Contrôle négatif: aucun échantillon n'est ajouté ou 1 µl d'eau stérile est ajouté;

Contrôle positif: ajouter 1 μl d'échantillon de contrôle positif, puis souffler doucement 5 fois avec ce pistolet d'addition de liquide de haut en bas;

Ensuite, 25 µl d'huile de paraffine (réaction dans un bain - Marie) sont ajoutés doucement au - dessus de la solution de chaque tube de réaction pour éviter que l'évaporation du liquide ne provoque des résultats inexacts. Faites attention à changer la tête du pistolet à chaque fois que vous ajoutez de l'huile de paraffine pour éviter la contamination croisée entre les échantillons. Si la réaction est effectuée dans un appareil PCR, il n'est pas nécessaire d'ajouter de l'huile paraffinique.

4) Réactions

Régler la température du bain - Marie ou de l'appareil PCR à 61 ° C, mettre dans le tube de réaction et incuber pendant 60 min;

Remarques:

1, la température réelle du bain d'eau peut différer de la température de réglage, il est recommandé de calibrer d'abord avec un thermomètre. En fait, les réactions 59 - 63 ℃ peuvent toutes être effectuées, mais affecteront la sensibilité de détection;

2Les produits de réaction ne peuvent pas être ouverts, sinon l'aérosol produit entraînera l'apparition de faux positifs pour les tests ultérieurs. Il est recommandé de bander le tube de réaction dans un sac en plastique ou des gants, de le jeter dans une poubelle spéciale et de le nettoyer à temps;

3, il n'est pas recommandé d'utiliser un four ou un bain métallique pour la réaction de chauffage;

5) Jugement des résultats

61 ℃ après 60 min de réaction, retirez immédiatement le tube de réaction et laissez - le à température ambiante. Observez les résultats de la réaction dans un environnement bien éclairé (papier blanc recommandé comme fond). Si le liquide réactionnel est encore bleu - violet, il est jugé négatif; Si le liquide réactionnel est bleu ciel, il est jugé positif.

Iv. Littérature pertinente

1, ShiyuHe, YanzhiHuang, YanlingZhao. AReverseTranscription-PolymeraseSpiralReaction(RT-PSR)-BasedRapidCoxsackievirusA16DetectionMethodandItsApplicationintheClinicalDiagnosisofHand,Foot,andMouthDisease. FrontièresMicrobiologie.2020; 12(11):734-743.

2, AudreyJean, Florence Tardy, Omran Allatif. Évaluation de la contamination du mycoplasme des cultures cellulaires par le PCRusin de l'étufuniverse par une paire d'amorceurs startigant un fragment de 1,5 kb de gènes d'ARN 16SrR. PLOSONE.2017; 12(2):e0172358.

3、ZohreSoheily, MohammadSoleimani, Keivan Majidzadeh-Ardebili. Détection de la contamination par mycoplasme de la culture cellulaire par la méthode d'amplification isothermique médiatée par boucle. CellJ.2019; 21(1):43-48.

4, XinXu, XueyuWang, WenHu. Enhanced Polymerase Cross-linkingSpiral ReactionAssay forRapid Diagnosticfor CanineParvovirus2 Infection. FrontiersinVeterinaryScience.2020; 7(57):1629-1636.