Détection d'hybridation in situ

NégociableMise à jour sur05/06

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Vue d'ensemble

Le principe de base de la détection d'hybridation in situ est l'utilisation de séquences de base complémentaires entre les brins simples de molécules d'acide nucléique, l'appariement complémentaire d'un acide nucléique exogène radioactif ou non radioactif (c'est - à - dire une sonde) avec l'ADN ou l'ARN à mesurer sur un tissu, une cellule ou un chromosome, la synthèse d'une molécule hybride d'acide nucléique spécifique, la localisation de l'acide nucléique à tester sur le tissu, la cellule ou le Chromosome étant révélée par certains moyens de détection.

Détails du produit

Méthode expérimentale Fish et étapes

Un. Dénaturation de la sonde

Incuber la sonde dans un bain d'eau thermostaté à 75 oc pendant 5 min, mettre immédiatement 0 Oc, 5 à 10 min, dénaturer la sonde d'ADN double brin.

II. Dénaturation des spécimens

① cuire les lamelles préparées de 5 à 8 µm dans un incubateur à 50 oc pendant 2 à 3 h. (les spécimens colorés par Giemsa doivent être préalablement décolorés dans le liquide de fixation avant d'être grillés).

② les échantillons de lamelles ont été prélevés et dénaturés dans une fraction volumique de 70 à 75 oc de Formamide à 70% / 2 × SSC pendant 2 à 3 min.

③ les spécimens sont immédiatement déshydratés par fractions volumiques de 70%, fractions volumiques de 90% et fractions volumiques de 100% d'éthanol glacé en série, dans l'ordre, pendant 5 min à chaque fois, puis séchés à l'air.

Trois. Hybridation

Une sonde d'ADN dénaturée ou précuite de 10 µl est goutte à goutte sur un spécimen de lamelle dénaturée et déshydratée, recouverte d'une lamelle de 18 x 18, scellée avec parafilm, placée dans une cassette humide pour hybridation à 37 oc pendant une nuit (environ 15 à 17 h). Étant donné qu'il y a moins de liquide d'hybridation et que la température d'hybridation est plus élevée et dure plus longtemps, ce processus est effectué dans une boîte humide afin de maintenir le spécimen humide.

Quatre. élution

Cette étape permet d'éliminer les sondes non spécifiquement liées et donc d'abaisser le fond.

(1) Le lendemain de l'hybridation, retirer le spécimen de l'étuve 37oc et retirer délicatement la lame avec une lame.

(2) Les spécimens de lamelles qui ont été hybridés ont été placés dans une fraction volumique de 50% Formamide / 2 x SSC préchauffée de 42 à 50 oc et lavés 3 fois pendant 5 min chacun.

(3) 3 lavages de 5 min chacun dans 1 × SSC préchauffé 42 ~ 50 oc.

(4) laver délicatement les spécimens de lames dans 2 × SSC à température ambiante.

(5) retirez les lames et séchez - les naturellement.

(6) prenez 200 μl de solution de reconditionnement (teinture PI / antifade ou dapi / antifade) et ajoutez - les goutte à goutte sur le spécimen de lamelle, couvrez - le.

V. Résultats Fish observés au microscope à fluorescence

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