Souris Interleukine 1β (il - 1β) ELISA Kit

1.Types d'échantillons et collecte:

sérumPour:Placer à température ambiante un échantillon de sang total recueilli dans un tube de séparation du sérum0,5 -2Heures ou4℃Nuit, puis1000×gCentrifugation20 Minutes, effacer ou mettre en-20℃ou-80℃Conserver, mais éviter la congélation et la dégel répétés.
Plasma sanguinPour:UtiliserEDTAOu l'héparine comme anticoagulant pour recueillir des spécimens et de mettre les spécimens après la collecte de30Dans les minutes2 - 8℃ 1000×gCentrifugation15Minutes, retirer pour détecter, ou mettre sur-20℃ou-80℃Conserver, mais éviter la congélation et la dégel répétés.

Homogénat de tissus:Avec pré - refroidiPBS (0,01 M, pH = 7,4)Rincer les tissus, éliminer le sang résiduel (les globules rouges lysés dans l'homogénat peuvent affecter les résultats de la mesure), après la pesée du tissu cisaillé avec le volume correspondantPBS(généralement presse1: 9Le rapport poids / volume, par exemple1 grammeLes échantillons de tissus correspondent9 mldePBS, le volume spécifique peut être ajusté de manière appropriée en fonction des besoins expérimentaux et bien documenté. Recommandé dansPBSAjouter un inhibiteur de protéase) dans un homogénateur en verre, bien broyer sur la glace. Pour lyser davantage les cellules tissulaires, l'homogénat peut être soumis à une fragmentation par ultrasons ou à des dégel - gels répétés. Enfin, l'homogénat est mis en5000×gCentrifugation5 à 10Minutes,à détecter,Ou mettre en place-20℃ ou-80℃ conserver, mais devrait éviter la congélation et la dégel répétées- Oui.

Lysat cellulairePour: Aspiration du liquide de culture, avecLes cellules sont lavées une fois avec du PBS (0,01 M, pH 7,4). Gratter les cellules et ajouter 2 - 5 ml de PBS (0,01 M, pH 7,4). Les cellules en suspension peuvent être omises. La suspension cellulaire est collectée, centrifugée 10 min à 1000xg à 4°C, le milieu est éliminé et lavé 3 fois avec du PBS prérefroidi. Ajouter la bonne quantité de PBS pré - refroidi ou de lysat cellulaire non dénaturé (inhibiteur de protéase ajouté avant utilisation) pour remettre en suspension les cellules, généralement la quantité de cellules d'un puits dans une plaque de 6 puits nécessite une remise en suspension de 150 à 250 μl de PBS. Mettre l'échantillon à - 20 ℃ ou - 80 ℃, de sorte que l'échantillon est congelé, puis la température ambiante décongeler l'échantillon, la congélation et la dégel à plusieurs reprises 3 fois, de sorte que les cellules sont suffisamment lysées, peut également faire l'échantillon à ultrasons cassé pour atteindre le but de la lyse. 4 ℃ 10000 × G centrifuger pendant 10 min, enlever les débris cellulaires, le retrait peut être détecté,Ou mettre en place-20℃ ou-80℃ conserver, mais devrait éviter la congélation et la dégel répétées- Oui.

Éclaircissement des cultures cellulaires ou autres spécimens biologiques:S'il vous plaît1000×gCentrifugation20Minutes, retirer pour détecter, ou mettre sur-20℃ ou-80℃ conservez, mais évitez la congélation et la dégel répétées.

2.Conservation et stabilité des échantillons

L'échantillon est dans2 - 8℃Dans les conditions, il peut être stocké72h， Dans- 20℃ou-80℃Peut être stocké6 mois etci-dessus.Après la collecte de l'échantillon, pas une fois l'essai terminé, s'il vous plaît diviser le stockage de congélation selon une quantité unique, éviter la congélation répétée et la dégel.

Étapes:

1. Numérotation: numéroter les micropores correspondants de l'échantillon dans l'ordre, chaque plaque doit être témoin négatif2 puits, contrôle positif 2 puits, contrôle blanc 1 puits (les puits de contrôle blancs n'ajoutent pas l'échantillon et le réactif d'étalonnage enzymatique, les étapes restantes fonctionnent de la même manière) et- Oui.

2. Addition: ajouter le contrôle négatif, le contrôle positif dans le trou de contrôle femelle, positif respectivement50μl。 Une dilution de l'échantillon de 40 µl est ensuite ajoutée au puits de l'échantillon à tester, puis 10 µl de l'échantillon à tester. Ajouter l'échantillon au fond du trou de la plaque de marquage enzymatique, essayez de ne pas toucher la paroi du trou, agitez doucement et mélangez.

3. Incubation: post - scellage de la plaque avec film de scellement37℃ incubation 30minute- Oui.

4. Dosage: seraLe liquide de lavage concentré 30X est conservé après dilution avec de l'eau distillée 30X.

5. Lavage: Retirez soigneusement le film de scellement, jetez le liquide,Sécher, remplir chaque trou avec du liquide de lavage, laisser reposerAbandonnez après 30 secondes, répétez 5 fois et séchez.

6. Addition d'enzymes: ajout d'un réactif étalon enzymatique par puits50μl， Sauf trou vide- Oui.

7. Incubation: post - scellage de la plaque avec film de scellement37℃ incubation 30minute- Oui.

8. Lavage: Retirez soigneusement le film de scellement, jetez le liquide,Sécher, remplir chaque trou avec du liquide de lavage, laisser reposerAbandonnez après 30 secondes, répétez 5 fois et séchez.

9. Rendu des couleurs: ajouter d'abord un agent de rendu des couleurs par trouA50μl, ajouter le révélateur de couleurB50μl, mélanger doucement,37℃ éviter le rendu de la lumière 10-20Minutes.

10.Terminaison: plus terminaison par trouLiquide50 μl, mettre fin à la réaction(le bleu tourne au jaune à ce moment - là)- Oui.

11.Détermination: mise à zéro dans un trou vide,450nmMesure séquentielle de la longueur d'onde de chaque trouAbsorption de lumièreDegrés (ODValeur). Le dosage doit être effectué après addition du liquide de terminaison15Faites - le en minutes.

Attention:

1. Préparation des réactifs: les kits sont retirés de l'environnement réfrigéré et doivent être équilibrés à température ambianteDisponible après 15 - 30 minutes. Préparer les marqueurs enzymatiques nécessaires pour une expérience, les autres peuvent être retirés de la microplaque, scellés et conservés conformément aux instructions pour la prochaine utilisation.

2. Échantillon supplémentaire: Veuillez utiliser une tête d'aspiration stérilisée jetable pour éviter la contamination dans l'opération expérimentale. Faites attention à ne pas avoir de production de bulles lors de l'ajout, appliquez l'échantillon au fond de la plaque de marquage enzymatique, essayez de ne pas toucher la paroi du trou, agitez doucement et mélangez. Comme pour l'addition des réactifs réactifs, le premier puits est dosé avec un intervalle de temps aussi faible que possible entre le dernier puits (généralement contrôlé dansDans les 10 minutes), si elle est trop grande, elle entraînera des temps de « pré - incubation» différents, ce qui affectera considérablement la précision et la répétabilité des mesures. Pour la précision de la mesure, il est recommandé de mettre en place des pores poreux pour l'expérimentation.

3. Incubation: pour éviter l'évaporation de l'échantillon, lors de l'expérience, veuillez placer le marqueur enzymatique plus le couvercle ou le film dans une boîte humide pour éviter l'évaporation du liquide, après le lavage de la plaque doit être effectué dès que possible pour l'opération suivante, à tout moment devrait éviter le marqueur enzymatique à l'état sec, en même temps, devrait strictement respecter le temps et la température d'incubation donnés.

4. Lavage:Liquide de lavage concentrépeut-êtreil y auraCristallisationDégagement, peut être chauffé dans un bain - Marie pour aider à la dissolution lorsqu'il est dilué, le lavage n'affecte pas le résultat. Un lavage adéquat est très important et, à chaque lavage, le liquide de lavage * doit être égoutté. Le liquide de lavage restant à l'intérieur du trou de réaction pendant le processus de lavage doit être séché sur le papier absorbant, ne mettez pas le papier absorbant directement dans le trou de réaction pour absorber l'eau, tout en effaçant doucement le liquide résiduel et l'empreinte de doigt sur le fond de la plaque pour éviter d'affecter La lecture finale de l'étalon enzymatique. Si vous utilisez un lave - plaque automatique, Réutilisez - le dans le processus d'expérimentation formel après une utilisation habile.

5. Contrôle du temps de réaction: après avoir ajouté le substrat, veuillez observer le changement de couleur des pores de réaction, par exemple en observant une couleur plus foncée, veuillez ajouter le liquide de terminaison à l'avance pour mettre fin à la réaction et éviter une réaction trop forte qui affecte la lecture de densité optique de l'étalon enzymatique.

6. Substrat: substrat s'il vous plaît conserver à l'abri de la lumière et éviter l'exposition directe à la lumière forte lors du stockage et de l'incubation.