Kit ELISA pour facteur inducteur d'apoptose (AIF) chez le rat

Kit de détection ELISA du facteur d'induction de l'apoptose (AIF) chez le rat

Principe de détection Pour:

Ce kit utilise un test d'immunoadsorption couplé à une enzyme sandwich à double anticorps ( ELISA）。 Dans le pré - paquet est Facteur d'induction de l'apoptose (AIF) chez le ratAnti - anticorps (anticorps en phase solide) dans une plaque enzymatique microporeuse, ajouter Facteur d'induction de l'apoptose (AIF) chez le rat Calibrateur et échantillon à tester, ajouter une autre souche Résistance au marquage HRP Facteur d'induction de l'apoptose (AIF) chez le rat (anticorps marqueur enzymatique), après incubation avec un lavage adéquat, élimination des composants non liés, formation d'anticorps en phase solide sur la surface de la phase solide de la microplaque - complexe sandwich d'anticorps marqueurs antigène - enzyme. Addition des substrats a et B, les substrats étant catalysés par HRP, on obtient un produit bleu qui, sous l'action d'un liquide de terminaison (acide sulfurique 2m), se transforme finalement en jaune, détermination de l'Absorbance (valeur OD) sur une longueur d'onde de 450 nm avec un étalon enzymatique, l'Absorbance (valeur OD) avec l'échantillon à mesurer Facteur d'induction de l'apoptose (AIF) chez le ratLa concentration est positivement corrélée. Ajustement de la courbe d'étalonnage, peut calculer dans l'échantillon Rats (AIF)La concentration.

Matériel et réactifs nécessaires

1, Marqueur enzymatique (filtre de longueur d'onde 450nm)

2,Incubateur à 37°c (incubateur CO2 pour cellules déconseillé)

3, Laveuse automatique de plaques ou pipette Multi - voies / 5 ml compte - gouttes (pour laver les plaques à la main)

4, Stérile Tube EP et tête d'aspiration jetable

5, Une voie précise (0,5 - 10 μl, 5 - 50 μl, 20 - 200 μl, 200 - 1000 μl) et une pipette multicanaux (la pipette doit être calibrée avant utilisation).

6,Papier absorbant et rainures d'échantillonnage

7,Eau désionisée ou distillée

Composition du kit:

Collection de spécimens Pour:

1、Le tube pour recueillir le sang doit être un tube jetable sans pyrogène et sans endotoxines.

2、 Anticoagulants plasmatiques utilisation recommandée EDTA 。 Évitez les échantillons hémolytiques, hyperlipidiques.

3、Les spécimens doivent être clairs et transparents et les matières en suspension doivent être enlevées par centrifugation.

4、 Après la collecte des spécimens, si elle n'est pas détectée à temps, s'il vous plaît Trier par quantité d'une utilisation, conserver congelé dans - 20 ℃, - 70 ℃ à l'intérieur du réfrigérateur électrique, évitez le gel et la dégel répétés, détection dans les mois de mars à juin.

5、 Si la concentration de l'agent de détection dans votre échantillon est supérieure à la valeur maximale de la norme, en fonction de la situation réelle, Faire la dilution multiple appropriée (une pré - expérience est recommandée pour déterminer le multiple de dilution).

Conditions de stockage:

Prélèvement et conservation des échantillonsPour:

1, Échantillon de sang total de sérum placé à température ambiante 2 heures ou 2 - 8°c pendant la nuit. Centrifuger à 1000 × g pendant 20 minutes et retirer les blancs. Immédiatement détectable ou conservée en une seule fois à - 20°C ou - 80°c.

2, Anticoagulants plasmatiques utilisation recommandée EDTA-Na2/K2， Centrifuger à 2 - 8°c pendant 15 minutes à 1000 × g dans les 30 minutes qui suivent le prélèvement de l'échantillon et retirer. Immédiatement détectable ou conservée en portions à - 20 °C ou - 80 °C en une seule utilisation. Pour l'utilisation et la sélection d'autres anticoagulants, consultez le Guide de préparation des échantillons.

3,Échantillons de tissus les échantillons de tissus sont généralement transformés en homogénat de tissus, la méthode de traitement est la suivante:
3.1, Placer le tissu cible sur la glace, avec pré - refroidi Le sang résiduel est éliminé par lavage en tampon PBS (0,01 M, pH = 7,4) et mis en réserve après pesée.

3.2, L'homogénat de tissu est broyé avec du lysat sur la glace. Le volume de lysat ajouté dépend du poids des tissus, en général chaque On utilise 9 ml de lysat pour 1 G de fragments de tissus. Il est également recommandé d'ajouter au lysat un inhibiteur de protéase tel que le PMSF 1 mm.

3.3, Broyage par ultrasons réutilisable ou gel - dégel répété traitement ultérieur (le refroidissement du bain de glace est nécessaire pendant le processus de fragmentation par ultrasons; la méthode répétée de gel - dégel peut être répétée 2 fois).

3.4, L'homogénat préparé est mis en Centrifuger à 5000 × g pendant 5 minutes, laisser clair pour la détection. Ou congeler à - 20°C ou - 80°c en une seule utilisation.

3.5, Selon les besoins expérimentaux, les échantillons d'homogénat tissulaire peuvent d'abord déterminer la concentration en protéines totales Pour faciliter l'analyse des données, la méthode BCA est recommandée. La concentration totale de protéines est généralement ajustée à 1 - 3 mg / ML pour la détection ELISA. Certains échantillons de tissus, tels que le foie, les reins et le pancréas, contiennent des concentrations plus élevées de peroxygénase endogène qui réagiront avec des substrats chromogènes en présence de concentrations plus élevées de l'échantillon et de faux positifs. On peut essayer d'inactiver 15 min de redétection avec 1% de H2O2.

Attention: Lysat couramment utilisé Tampon PBS, ou utiliser un lysat Ripa de force moyenne. Lors de l'utilisation, la valeur du pH doit être ajustée à ph7,3, en évitant l'utilisation de composants contenant du NP - 40, du Triton X - 100 et du DTT, ce qui inhibera considérablement le fonctionnement du kit. 50mm tris + 0,9% NaCl + 0,1% SDS, pH 7,3 est recommandé et peut être formulé vous - même ou acheté en nous contactant.

4, Le surnageant est collecté sur culture cellulaire, Centrifuger à 2 - 8°c, 2500 RPM pendant 5 min et recueillir le surnageant de culture cellulaire clarifiée. Utilisez - le immédiatement pour la détection ou conservez - le à - 80 ° C en une seule portion.

5,Lysat cellulaire

5.1, Collecte et lyse des cellules en suspension: 2 - 8°c, centrifugation à 2500 RPM pendant 5 min, collecte des cellules. Ajouter à nouveau du PBS pré - refroidi et mélanger doucement pour nettoyer, 2 - 8 ° C, centrifuger à 2500 tr / min pendant 5 min et recueillir les cellules. Ajouter 0,5 - 1 ml de lysat cellulaire et une quantité appropriée d'inhibiteur de protéase (par exemple, PMSF, concentration de travail de 1 mmol / l), mettre sur la glace, lyser pendant 30 min - 1 h, ou en conjonction avec la fragmentation par ultrasons.

5.2, Collecte et lyse des cellules adhérentes: aspirer le surnageant, ajouter le prérefroidi PBS laver trois fois. Ajouter 0,5 - 1 ml de lysat cellulaire et une quantité appropriée d'inhibiteur de protéase (par exemple, PMSF, concentration de travail de 1 mmol / l) et gratter doucement les cellules murales avec un raclage cellulaire. La suspension cellulaire est transférée dans un tube de centrifugation, placée sur de la glace, lysée pendant 30 min - 1 h ou concassée par ultrasons.

5.3, Le tube de centrifugation peut être soufflé par la tête du pistolet ou secoué de manière intermittente pendant le processus de lyse cellulaire pour permettre la lyse adéquate des protéines L'apparition de la pâte est l'ADN, peut utiliser des ultrasons pour briser l'ADN. (ou avec la sonde ultrasonique 3 - 5mm, puissance 150 - 300W, ultrasons sur la glace pour traiter l'échantillon, travail 1 - 2 secondes, arrêt 30 secondes, 3 ~ 5 cycles. ) et

5.4, Le craquage ou la fragmentation par ultrasons est terminé, 2 - 8 ° C, 10 000 tr / min centrifuger pendant 10 min, le surnageant est déplacé dans le tube EP immédiatement pour la détection ou emballé en une seule quantité d'utilisation à - 80 ° C pour la conservation par congélation.

Kit de détection ELISA du facteur d'induction de l'apoptose (AIF) chez le rat

Attention:Précautions à prendre avec des échantillons de tissus.

Note: ce qui précède est pour référence seulement! Espérons que les informations ci - dessus vous aideront à faire le bon choix!