En chromatographie liquide préparative, la colonne de protection est la première ligne de défense qui protège la colonne d'analyse principale et son rôle consiste à adsorber les impuretés de l'échantillon (telles que les particules, les composants fortement retenus, les perturbateurs matriciels, etc.) en évitant la contamination ou le colmatage de la colonne principale. Comme la préparation de la phase liquide traite généralement des échantillons de grande concentration et de grand volume, la colonne de protection perd rapidement, de sorte que le mode de conservation scientifique est essentiel pour prolonger sa durée de vie et garantir l'efficacité de la séparation. Voici la stratégie de conservation et les points opérationnels pour la préparation de la colonne de protection en phase liquide:

I. rôle de la colonne de protection et mécanisme de perte

1. Fonctions de base

- intercepter les particules (p. ex. solides non dissous, microparticules) dans l'échantillon et empêcher l'obstruction de la plaque de tamis d'entrée de la colonne principale;

- L'adsorption retient fortement les impuretés (telles que les composants liposolubles, les protéines, etc.) et évite la contamination de la phase stationnaire de la colonne principale;

- stabilise le Front de phase d'écoulement, réduit l'impact direct de l'échantillon avec la colonne principale.

2. Causes de perte

- blocage physique: accumulation de particules microscopiques ou de matières colloïdales dans l'échantillon;

- surcharge d'adsorption chimique: une forte concentration d'impuretés dépasse la limite de capacité de la colonne de protection;

- contamination biologique: protéines, résidus microbiens entraînant une diminution de l'efficacité de la colonne (notamment dans les systèmes en phase aqueuse);

- attaque en phase mobile: les solvants incompatibles (par exemple acides forts / bases) détruisent la structure de remplissage de la colonne de protection.

II. Spécifications des opérations quotidiennes de conservation

1. Préparation avant l'installation

- confirmation de la direction: la direction de la flèche d'identification de la colonne de protection doit être cohérente avec la direction du flux, afin d'éviter la perte de remplissage causée par le contre - Chargement;

- inspection des joints: utilisez des joints à volume mort nul (p. ex. 1 / 16 Po ou 1 / 8 po) avec un diamètre de colonne adapté pour éviter la propagation des courants de Foucault;

- activation initiale: la nouvelle colonne de protection doit être bien équilibrée avec la phase mobile cible (débit recommandé 5 - 10 ml / min, volume de rinçage ≥ 30 ml), en évacuant l'air du remplissage.

2. Optimisation du traitement avant échantillon

- filtration et déparasitage: l'échantillon doit être filtré sur une membrane filtrante de 0,22 μm pour éliminer les particules en suspension;

- clarification par centrifugation: centrifugation à grande vitesse (par exemple 10 000 tr / min, 10 minutes) d'un échantillon de turbidité, prélèvement d'un échantillon de surnageant;

- contrôle de la dilution: les échantillons à haute concentration doivent être dilués dans la plage de capacité d'adsorption de la colonne de protection pour éviter une surcharge instantanée.

3. Gestion de la phase mobile

- Compatibilité du pH avec les solvants: la protection des charges de colonne (par exemple C18, scx, etc.) doit correspondre à la plage de pH de la phase mobile (généralement 2 - 8) pour éviter la corrosion acide / alcaline forte;

- lavage après élution en gradient: Si vous utilisez l'élution en gradient, vous devez rincer la colonne de protection ≥ 10 ml avec la phase mobile initiale après la fin, pour éviter le relargage ou les résidus de substances hydrophobes;

- gestion des sels tampons: la phase mobile contenant des sels tampons doit être rincée régulièrement par substitution d'eau pour éviter le colmatage de la cristallisation du sel.

4. Surveillance de pression et protection de limitation de courant

- réglage du seuil de pression différentielle: la chute de pression normale de la colonne de protection est généralement de 1 à 3 Bar (débit de 10 ml / min), si la pression différentielle augmente de plus de 50%, le risque de blocage est indiqué;

- Stratégie de remplacement: en fonction de la complexité de l'échantillon, il est recommandé de remplacer obligatoirement la colonne de protection après chaque traitement de 50 à 100 échantillons entrants.

Iii. Régénération et réparation des colonnes de protection

1. Méthode de régénération chimique

- lavage inverse: colonne de protection saturée en adsorption, lavage inverse avec solvant organique élevé (méthanol, acétonitrile par exemple), débit 5 - 10 ml / min, volume de rinçage ≥ 50 ml, élution des impuretés faiblement adsorbées;

- régénération par élution graduée: pour les impuretés fortement retenues, on utilise une élution graduée (Gradient méthanol - eau par example), on augmente progressivement la proportion de phase organique, on rince par étapes;

- nettoyage spécial au solvant: les impuretés liposolubles peuvent être rincées à l'alcool isopropylique ou au tétrahydrofuranne et la contamination protéique peut être nettoyée avec une solution aqueuse de TFA à 0,1%.

2. Moyens de réparation physique

- assistance par ultrasons: retirer le remplissage de la colonne de protection (si nécessaire), immerger dans le solvant pour soniquer pendant 10 - 15 minutes, recharger;

- nettoyage de la plaque d'écran: Retirez la plaque d'écran d'importation et d'exportation, rincez - la avec une brosse à poils doux ou de l'eau ultra pure pour éliminer les particules d'emboîtement.

3. Vérification des effets de régénération

- test d'efficacité de la colonne: injection de substances étalons (par exemple benzène, naphtalène) après régénération, pour détecter si le nombre de plateaux est revenu à plus de 80% de la valeur initiale;

- blank Run Baseline: rincer avec une phase fluide jusqu'à ce que la ligne de base soit lisse, sans pic fantôme ni phénomène de traînée.

Iv. Temps de stockage et de remplacement de la colonne de protection

1. Suspension d'utilisation à court terme

- conservation par voie humide: remplir la colonne de protection avec une phase mobile initiale ou une solution méthanol - eau (1: 1), les deux extrémités étant scellées contre le dessèchement;

- protection contre la lumière à basse température: température de stockage recommandée 4 - 25 ℃, éviter la destruction de la structure de remplissage causée par la congélation.

2. Traitement de désactivation à long terme

- lavage: rinçage séquentiel au méthanol, à l'eau, au méthanol, élimination des sels tampons et des résidus organiques;

- conservation à sec: après soufflage d'azote ou séchage sous vide, le joint est conservé dans le séchoir.

3. Remplacement des critères de jugement

- anomalie de pression différentielle: chute de pression supérieure à 2 fois la valeur initiale au même débit;

- diminution de la séparation: décalage du temps de rétention du pic principal > 10% ou traînée importante du pic;

- pénétration d'impuretés: contamination anormale de la colonne principale (p. ex. résidus de pics inconnus), remplacement de la colonne de protection après exclusion d'autres facteurs.

V. précautions et erreurs courantes

1. Évitez la « surprotection »

- les colonnes de protection ne sont pas omnipotentes, si la concentration d'impuretés de l'échantillon est élevée (par exemple, extrait brut), plusieurs colonnes de protection doivent être connectées en série ou un prétraitement hors ligne est préféré (par exemple, extraction en phase solide).

2. Interdire le fonctionnement de la colonne sèche

- l'assèchement de la colonne de protection peut provoquer la fissuration du remplissage, le chemin d'écoulement de l'eau est modifié et doit toujours être maintenu humide.

3. Ne pas dépasser l'opération de débit

- le débit de la phase liquide de préparation est plus élevé (généralement 10 - 50 ml / min), mais le débit de la colonne de protection doit correspondre strictement à sa limite supérieure de conception (par exemple, la valeur de résistance à la pression du remplissage) pour éviter les dommages mécaniques.

4. Enregistrement des journaux de maintenance

- enregistrement de la pression différentielle, du solvant de rinçage, du nombre de régénération et de la date de remplacement après chaque utilisation, afin de fournir un support de données pour les optimisations ultérieures.