La colonne de chromatographie de remplissage est un composant central de l'analyse chromatographique et ses performances affectent directement l'effet de séparation et la précision de détection. Le processus d'utilisation des spécifications scientifiques peut améliorer considérablement l'efficacité de la colonne et prolonger sa durée de vie, les points clés suivants sont détaillés dans la préparation avant le chargement, l'opération d'échantillonnage, la gestion opérationnelle et la maintenance.

I. pré - traitement avant le chargement

Tamisage et nettoyage des colonnes chromatographiques

Les charges adaptées (par exemple C18 apolaire, gel de silice polaire) sont sélectionnées en fonction de la polarité de la cible et les colonnes chromatographiques anciennes et nouvelles doivent être nettoyées par ultrasons méthanol / acétonitrile pendant 30 minutes pour éliminer les résidus de conservateur.

Le tube de colonne vide est d'abord trempé avec de l'acide chlorhydrique dilué pendant 2 heures, rincé à l'eau pure jusqu'à neutralité, puis rincé au méthanol pour s'assurer que la paroi intérieure n'est pas perturbée par des impuretés hydrophobes.

Préparation et remplissage de l'homogénat

Lors du remplissage par la méthode de décantation, le remplissage est mis en suspension homogène (teneur en solides d'environ 5%), l'aspiration à l'aide d'une pompe à vide permettant l'accumulation étanche du remplissage; Le remplissage par voie sèche nécessite une couche pour frapper le corps de la colonne et éliminer les vides.

Les deux extrémités du lit de colonne sont équipées de panneaux de tamis (diamètre des pores < taille des particules de remplissage 1 / 3) pour empêcher les fuites de remplissage, le dessus est pressé dans la laine de verre pour fixer.

II. Contrôle d'échantillonnage et de fonctionnement

Équilibre et activation

Lorsque la nouvelle colonne est utilisée, les bulles sont évacuées par rinçage à faible débit de phase mobile initiale (0,5 ml / min) pendant 2 heures; La colonne inverse doit augmenter progressivement la proportion de phase organique aux conditions de travail pour éviter l'effondrement de la phase stationnaire.

Calibré avec une ligne de base de phase mobile vierge avant d'entrer dans l'échantillon, pour commencer l'expérience après stabilisation du signal du détecteur UV.

Principes d'optimisation des paramètres

Contrôle du débit: maintenir la vitesse linéaire optimale (HPLC est généralement de 1 ~ 2 mm / s), trop intensifier la diffusion du vortex, trop bas conduit à une augmentation de la résistance au transfert de masse.

Limites de la plage de ph: la matrice de gel de silice évite un pH > 8, la gamme de tolérance de la charge polymère est plus large, mais le pH spécial accélère la rupture de la liaison caudale.

Gestion de la température: l'élévation de la température de la colonne peut améliorer la forme du pic, mais plus de 60 ℃ est susceptible de provoquer une perte de phase de liaison, doit être combinée avec le module de contrôle de la température pour contrôler la température avec précision.

Iii. Entretien quotidien et régénération

Stratégies de lutte contre la pollution

Les contaminants liposolubles sont lavés avec un gradient (par exemple méthanol → dichlorométhane → méthanol); Le résidu ionique est rincé avec une solution saline (NaCl 0,1 m).

Retirez la tête de colonne en cas de blocage sévère, éliminez la couche supérieure de remplissage détérioré et reconditionnez après avoir complété avec du remplissage frais.

Spécifications de conservation à long terme

Inactivité à court terme (< 1 semaine): mise sous scellés dans des récipients hermétiquement fermés contenant une phase mobile et rinçage électrique pendant 30 minutes par semaine;

Stockage à long terme (> janvier): remplacer par un mélange acétonitrile / Isopropanol (1: 1), placer debout à l'ombre après avoir scellé les deux extrémités.

Iv. Principales considérations

Inhibition des conditions de brusque: transition en escalier nécessaire lors de la commutation de la phase mobile, empêchant les mutations de la viscosité du solvant de déclencher de violentes fluctuations de la pression de la colonne; Remplacer la solution de sel tampon par un solvant inerte (par exemple, l'acétonitrile) avant l'arrêt.

Traitement pré - échantillon: les échantillons biologiques complexes doivent être purifiés par la colonne SPE pour éviter que la précipitation de protéines ne bloque le lit de la colonne; Le volume de l'échantillon entrant ≤ 1% de la capacité de la colonne, la surcharge entraînant un remorquage sévère.

Diagnostic de phénomènes anormaux: l'augmentation continue de la pression de la colonne indique une accumulation de particules, une dérive de base suggère un déséquilibre biphasique, des pics fantômes apparaissent en raison de la pollution du système.

Le nombre théorique de plateaux remplissant la colonne chromatographique peut être maintenu à plus de 90% de la valeur initiale, avec un écart temporel d'analyse unique < 2%, grâce à des opérations de raffinage et à un entretien régulier. Dans les applications pratiques, il est nécessaire d'établir des processus normalisés en combinaison avec des caractéristiques de remplissage spécifiques et d'enregistrer les courbes d'atténuation de l'efficacité de la colonne pour un remplacement rapide.