Un,Tube centrifuge d'ultrafiltrationOptimisation des paramètres centrifuges

Vitesse de rotation et temps

La centrifugation initiale est recommandée pour démarrer à 70% de la vitesse de rotation recommandée (par exemple, 3000 × G centrifugation pendant 10 minutes), avec un ajustement progressif à 4000 × g Après avoir observé le débit, mais sans dépasser la limite de tolérance de la membrane filtrante.

Le temps de traitement typique est de 10 à 30 minutes, selon le poids moléculaire retenu (mwco) et le volume de l'échantillon.

Contrôle de la température

La centrifugeuse doit être pré - refroidie à 4 ° C pour réduire l'adsorption de dénaturation thermique. Les environnements à basse température peuvent prolonger la durée de vie de la membrane, mais il est important de noter que le temps de concentration peut être prolongé.

Accélération et équilibre

L'accélération centrifuge est portée au rapport le plus bas, réduisant la pression sur la membrane.

Assurez - vous que la masse du tube d'ultrafiltration apparié est équilibrée avec le Centre de gravité et que la cartouche est placée dans une position et une direction cohérentes, évitant ainsi les secousses ou les dommages pendant la centrifugation.

II. Stratégie d’amélioration du taux de récupération

Sélection de membranes filtrantes et prétraitement

Les membranes d'ultrafiltration dans lesquelles mwco est 2 - 3 fois plus petite que la molécule cible sont sélectionnées en fonction du poids moléculaire cible. Par example, pour un poids moléculaire de la protéine cible de 35 kDa, on choisit un tube d'ultrafiltration de 10 kDa de poids moléculaire emprisonnant.

Les membranes d'ultrafiltration des tubes centrifuges d'ultrafiltration nouvellement achetés contiennent des traces de glycérine, qui doivent être trempées dans de l'eau pure ou du tampon et placées au réfrigérateur pendant 10 minutes avant utilisation. Après cela, versez de l'eau pure et placez le tube d'ultrafiltration sur la glace pendant 2 à 5 minutes supplémentaires.

Traitement et ajout d'échantillons

Les échantillons sont filtrés à l'avance avec une membrane filtrante de 0,22 µm, ce qui évite que les particules n'obstruent la membrane d'ultrafiltration.

Ajouter lentement l'échantillon au tube d'ultrafiltration, le niveau du liquide ne dépassant pas le Réticule maximal. L'opération doit être légère lors de l'ajout et éviter de détruire la structure de la membrane.

Concentration et élution

Toutes les 5 minutes pendant la centrifugation, la couche piégée est doucement soufflée avec un pistolet à pipette pour empêcher l'accumulation de macromolécules de former une couche dense de polarisation différentielle.

Le volume de rétention est contrôlé entre 1 / 10 et 1 / 20 de la taille de l'échantillon original. Un multiple de concentration trop élevé conduit facilement à l'agrégation des protéines et peut être déplacé par l'ajout d'un tampon à mi - parcours de l'Ultrafiltration, concentré par étapes.

Pour les échantillons épais (par exemple, contenant du glycérol ou du saccharose), la vitesse de rotation doit être réduite de 10 à 20% et le temps de centrifugation prolongé.

Opérations de recyclage

Après centrifugation, les grosses molécules restent dans la couche supérieure et les petites molécules et le solvant passent par la membrane dans la couche inférieure. Le filtrat du tube externe est une substance à petites molécules et un solvant; Le liquide du tube interne est une substance macromoléculaire.

Si vous souhaitez collecter la substance macromoléculaire, prenez un autre tube externe et centrifugez le tube interne à l'envers à 1000 × g pendant 1 - 2 minutes.

Iii. Questions fréquemment posées et solutions

Protéines manquantes ou non détectées

Causes: mauvaise sélection de la membrane filtrante, paramètres de centrifugation inappropriés, concentration initiale de l'échantillon trop faible, etc.

Solution: sélectionnez à nouveau la membrane filtrante mwco appropriée, Ajustez les paramètres de centrifugation et assurez - vous que la concentration initiale de l'échantillon est supérieure à 25 μg / ML.

Blocage de la membrane ou débit trop lent

Causes: excès de particules dans l'échantillon, contamination de la membrane filtrante, etc.

Solution: les échantillons sont filtrés à l'avance et la membrane filtrante est régulièrement lavée ou remplacée. Lorsque la membrane est bloquée, elle est immergée pendant 1 heure avec du NaOH 0,1 m et rincée trois fois à l'eau pure.

Faible taux de recyclage

Causes: Adsorption de la membrane filtrante, mauvais fonctionnement, etc.

Solution: réduire l'adsorption non spécifique en fermant au préalable la membrane filtrante avec 1% de BSA pendant 30 minutes. Faites attention à la douceur lors de l'opération pour éviter de détruire la structure de la membrane.

Précipitation du rétentat après ultrafiltration

Causes: concentration trop élevée en protéines, buffer inapproprié, etc.

Solution: Ultrafiltration simultanée avec plusieurs tubes d'ultrafiltration pour réduire la concentration; Changez un buffer différent jusqu'à ce que la protéine ne précipite pas. Pour le précipité, il est à nouveau centrifugé après dissolution de l'urée 8m disponible.

Iv. Entretien et maintenance

Nettoyage et désinfection

Tube centrifuge d'ultrafiltration à usage unique, à jeter directement après utilisation.

En cas de réutilisation, le tube d'ultrafiltration fini est lavé 5 fois avec de l'eau pure, puis trempé avec du NaOH 0,1 m pendant 1 à 2 heures, puis lavé avec de l'éthanol à 20% et lavé 3 fois avec de l'eau Ultrapure ou du tampon. Il n'est généralement pas recommandé de réutiliser le tube d'ultrafiltration plus de 5 fois.

Conservation à long terme

Conservation à court terme: tremper avec NaOH 0,1 m pendant 1 à 2 heures, laver à l'eau pure 3 fois, puis tremper avec de l'éthanol à 75%, assurez - vous que la membrane filtrante reste humide et ne peut pas faire germer.

Conservation à long terme: tremper 1 - 2 heures avec NaOH 0,1 m, laver 3 fois avec de l'eau pure, puis tremper avec de l'éthanol à 20%, assurez - vous que la membrane filtrante reste humide et ne peut pas faire germer.