Malgré le succès de la stratégie de dépistage précédente utilisée par les auteurs pour identifier les variantes de remplacement du gène humain pour le gène de la levure, cette stratégie était fastidieuse et n'a identifié que 2 inhibiteurs (kachroo et al., 2015). Cette technique nécessite une séparation artificielle des colonies, puisQuartileL'isolement, et l'identification des inhibiteurs, nécessite le criblage manuel de centaines de colonies de levures. Les auteurs ont donc développé un nouveau procédé de criblage de plasmides inhibiteurs de manière automatisée à haut débit (figure 1a).

Les auteurs se sont particulièrement concentrés sur le dépistage des mutations inhibitrices dans la protéine bêta - 2C humaine non complémentaire (hspsmb7), une sous - unité du protéasome exprimée de manière constitutive. Cette méthode permet un dépistage massif et infaillible en un temps considérablement réduit. Les expériences ont été réalisées sous forme de plaques 96 puits et par synthèse de réseaux génétiques (SGA), ou la méthode de sélection mm pour isoler les mutants haploïdes spécifiques, de sorte qu'il n'est pas nécessaire d'effectuer une séparation quaternaire (PAN et al., 2004; Kuzmin et coll., 2016). L'effet de complémentation a été confirmé en relation avec un gène humain variant sur un plasmide à base d'ura3 par un test de dépendance plasmidique utilisant la sélection 5 - FOA. En utilisant cette stratégie, les auteurs ont réussi à obtenir plusieurs mutations inhibitrices substituables dans le gène hspsmb7. Tout au long de l'article, les auteurs ont toujours utilisé les termes « remplacement fonctionnel», « substituabilité» ou « capacité remplaçable» pour désigner la capacité d'un gène humain ou de ses variants à compenser la fonction de son gène homologue de levure. Ce processus de sélection a été développé sur la base de plusieurs considérations. Le psmb7 humain sauvage (β2c) ne peut pas remplacer le gène homologue de la levure β2, scpup1, comme en témoigne le phénotype mortel observé lors de l'élimination sélective du gène de la levure (figure 1b, complémentaire à la figure 1B) (cahero et al., 2015). En revanche, si un gène humain (ou un variant de celui - ci) réussit à remplacer la fonction du gène hôte, la souche sera capable de croître, servant ainsi de simple indicateur de détection de la substitution fonctionnelle. La stratégie de PCR avec un taux d'erreur plus élevé a généré un pool de gènes mutants hspsmb7 dans un vecteur d'expression de levure portant le marqueur ura3, avec une moyenne de 1 à 4 mutations par gène (figure 1a).

Pour déterminer si l'allèle psmb7 muté peut compenser la létalité causée par la suppression du gène de levure homologue, les auteurs ont converti la Banque de gènes mutés dans une souche diploïde de levure hetko pup1 / pup1Δ:: kanmx (PAN et al., 2004). Le Protocole de transformation a été étendu pour obtenir des milliers de colonies de levures isolées les unes des autres, chacune portant un plasmide différent du gène muté psmb7 (figure 1B). Des milliers de colonies ont été sélectionnées de manière automatisée à l'aide du qpix 460 et ensemencées sur un milieu GNa présporé au format 96 puits, etG418La méthode de sélection filtre pup1Δ avec le marqueur kanmx. Après sporulation, des spores viables de levure haploïde pup1Δ:: kanmx portant différents allèles humains psmb7 (en présence de g418) ont pu être sélectionnées en milieu mm (sans Leu, ARG, his, URA et CAN) (Figure 1c, panneau inférieur). En tant que contrôle interne de l'efficacité de la sporulation, les auteurs ont également testé la croissance de spores haploïdes pup1 de type sauvage sur milieu mm (sans g418) (Figure 1c, panneau supérieur). Les résultats du criblage montrent que 19 colonies cultivées sur milieu mm + g418 (image représentative de la figure 1d) peuvent porter des variants humains complémentaires de psmb7. Ces mutants inhibiteurs haploïdes ont ensuite été testés pour déterminer si l'inhibition était due au transport d'un gène mutant humain dans le plasmide. La dépendance plasmidique des cellules de levure a été testée en fonction du manque de croissance de 5 - FOA (qui inhibe le gène ura3). Sept de ces 19 mutants inhibiteurs ne survivent pas sur milieu 5 - FOA, ce qui suggère que les variants génétiques humains de ces souches sont nécessaires à leur survie (figure 1d).

Idéalement, humaniser les levures pour caractériser fonctionnellement les gènes humains exploiterait les allèles humains de type sauvage dans les levures. Cependant, le criblage inhibiteur et les données d'échange de queue C - terminale suggèrent que le bêta - 2C humain nécessite des mutations qui interagissent avec les sous - unités de levure voisines, en particulier SC - bêta - 3, pour s'assembler correctement dans le CP de levure. Par conséquent, les stratégies visant à restaurer ces interactions de sous - unités spécifiques à l'homme pourraient permettre l'intégration de hspsmb7 sauvage dans le protéasome de levure. Pour vérifier cette hypothèse, les auteurs ont demandé si le bêta 2C humain de type sauvage pouvait remplacer fonctionnellement son homologue de levure dans la souche. Les auteurs ont développé une approche basée sur crispr - cas9 pour cibler les gènes scpup1 (β2) et scpup3 (β3) de la levure. Les levures transformées par plasmide exprimant cas9 - sgrnascpup1 ou cas9 - sgrnascpup3 provoquent leur mort. Si les gènes humains sont capables de remplacer fonctionnellement la levureGènes homologuesEnsuite, un modèle de réparation du gène humain contenant les séquences homologues terminales 5 'et 3' des sites de levure correspondants est cotransformé, ce qui devrait donner des cellules viables.

Les auteurs ont d'abord testé si le type sauvage hspsmb7 pouvait remplacer scpup1 pour jouer un rôle sur le site du gène in situ, mais n'ont pas réussi à obtenir de colonies viables, comme prévu (Figure 2A). Cependant, avec le variant hspsmb7 présentant la mutation t44a ou s214g, le gabarit de réparation permet de remplacer fonctionnellement le gène pup1 de la levure (Figure 2B). Auparavant, les auteurs ont montré que lorsque le gène bêta 3 (pup3) de la levure est exprimé sur un plasmide, il peut être remplacé fonctionnellement par son homologue humain (hspsmb3) (kachroo et al., 2015). En utilisant la stratégie crispr - cas9 basée sur le HDR (Akhmetov et al., 2018), les auteurs ont réussi à remplacer le gène bêta 3 (hspsmb3) de la levure analytique par le gène bêta 3 (hspsmb3) de l’homme (figure 2c). Ainsi, la Sous - unité bêta - 2 de la levure est capable de recruter la Sous - unité bêta - 3 humaine dans le site central du protéasome de la levure, mais la Sous - unité bêta - 2C humaine ne peut pas jouer ce rôle avec la Sous - unité bêta - 3 de la levure. Une souche de levure bêta - 3 humanisée a d'abord été utilisée et la technologie d'édition de gènes basée sur crispr - cas9 est maintenant capable de remplacer le gène bêta - 3 de la levure par le gène bêta - 2C humain de type sauvage (hspsmb7). La souche de levure double HS β2c - HS β3 est viable, ce qui est possible par PCR spécifique au site etSéquençage SangerIl a été vérifié (figure 2d).

Ainsi, en fournissant sa sous - unité humaine adjacente, le bêta - 3 humain, souvent non complémentaire, est maintenant capable de fonctionner dans le protéasome de levure. Cependant, l'apport de bêta 3 humaine dans la levure ne permet pas à la levure bêta 2 d'obtenir une complémentation par HS bêta 2i. La détermination quantitative de la croissance a révélé un défaut d'adaptation modeste chez les souches modifiées. La souche humanisée HS beta2c - s214g présentait un déficit de croissance sensible à l'hypothermie à 23 °C, tandis que la souche humanisée HS beta2c - t44a avait une croissance plus lente à 23 °C et à 37 °C que la souche sauvage. De plus, alors que la souche humanisée HS β3 est comparable à la croissance de levures de type sauvage, la souche humanisée HS β3 - HS β3 présente un phénotype sensible aux basses températures à 23 °C et une croissance plus lente à 30 °C en culture liquide.