L'autophagie comme cible prometteuse pour la pharmacothérapie

Autophagie et ses dérèglements ont été découverts dans les maladies neurodégénératives et le cancerJouerJoue un rôle important et, par conséquent, la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques dans ce processus est devenue une approche pharmacothérapeutique prometteuse. Autophagie est un processus de régulation qui dégrade et récupère les protéines endommagées et les organites sous stress cellulaire1，2- Oui.êtreSacs appelés autophagosomesBulles à traversFormation d'une double Membrane autour des composants cellulaires marqués pour la destructioneffectuerAssemblage1. les vésicules autophagosomales fusionnent ensuite avec les lysosomes, transmettant leur contenu pour la dégradation enzymatique lysosomale.

L'autophagie a une variété d'effets physiologiques et physiopathologiques complexes, tels que l'adaptation à la faim nutritionnelle, l'élimination des protéines intracellulaires endommagées et des organites, le développement cellulaire, l'anti - vieillissement, l'élimination des micro - organismes, la mort cellulaire, la suppression des tumeurs et la présentation des antigènes.2. La Division mitochondriale est la dégradation sélective des mitochondries par autophagie3. Le processus peut généralementAvecÉlimine les mitochondries défectueuses après des dommages cellulaires ou un stress.

Matériaux

• PC12Lignée cellulaire de neuroblastome humain (ATCC) et

• 384 Plaque de trou (Greiner) et

• Id de la cellule ®Kit de détection autophagique (ENZO Sciences de la vie) et

• Colorant mitochondrial orange

• Hoechst 33342

• ImageXpressLe Pico®Systèmes automatisés d'imagerie cellulaire (Dispositifs moléculaires) et

• CellReporterXpress Logiciel d'acquisition et d'analyse de données(Dispositifs moléculaires) et

Avantages

Effet des composés quantitatifs sur le processus d'autophagie

Segmentation des cellules à l'aide de marqueurs nucléaires, détection et caractérisation de petitesLes objets cibles

Garantir des résultats statistiques fiables grâce à l'imagerie automatique

Détection et quantification des particules autophagosomales par imagerie cellulaire automatisée

Évaluer l'impact sur l'autophagie

Dans cette note d'applicationNous avons évaluéImageXpressPicoEfficacité des systèmes automatisés d'imagerie cellulaire pour détecter et quantifier les particules autophagosomales.PC12Les lignées cellulaires de neurocytome humain ont été utilisées comme modèles de développement de tests. Mettre les cellules à 6，000 unLes cellules/Inoculation des trous à384Dans la plaque de puits, incubation48Heures. Pour évaluer les effets sur l'autophagie,FaireTraitement des cellules avec différentes concentrations de chloroquine ou de vérapamil48Heures. VillapamipouvoirL'autophagie est induite, tandis que la chloroquinepouvoirInhibition de la dégradation des autophagosomes conduisant à l'accumulation de particules.ComposésAprès traitement, utilisezId de la cellule ®Détection autophagiqueKit pour vivreLes cellules sont colorées pourMontrerLe traceurAutophagosomes. De plus, nous utilisons des colorants mitochondriaux fluorescents pour détecter les mitochondries etHoechstIdentification du noyau (ConcentrationRespectivement 0.2 μMet 1 μM). utiliserMatch avec20Xou40XObjectifdeImageXpressPicoSystème ainsi que trois canaux de détection(FITCEt,TRITCetFluorescence bleue) etAux cellulesEffectuer l'imagerie. Dans20XObjectifChaque trou inférieur acquiert une image, dans40XSous l'objectifChaque trouAcquisition2-4Image pour assurer des résultats statistiques fiables. utiliserCellReporterXpressL'autophagie ou le Protocole d'application mitochondriale dans le logiciel d'acquisition et d'analyse d'images analyse les images.

Figure 1Pour:Détection des autophagosomes.L'image ci - dessus montrepasserInducteur d'autophagie chloroquine (30 pM) traitées etFaireutiliserId de la celluleColorant teintPC12Images représentatives des cellules autophagiques et masque d'analyse. DansCellReporterXpressDans le logiciel, utilisez la segmentation par points pour identifier les particules autophagiques. Noyau cellulaireAfficher commeBleu, mitochondriesAfficher commeOrange, autophagieAfficher commeVert. basFigureafficherFaitColoration des cellules non traitées avec un colorant orange d'intégrité mitochondriale- Oui.Masque d'image et d'analyse pour la détection mitochondriale..

Ces algorithmes peuventAvecDétection et caractérisation SmallLes objets ciblesComme les autophagosomes ou les mitochondries dans le cytoplasme, tout en utilisant des marqueurs nucléaires pour segmenter les cellules. Quantification pour la détection de l'autophagiedétectionComprend le nombre total ou moyen de particules, la surface totale ou moyenne des particules (objets subcellulaires) et la force. Avec la chloroquine (30 μM) TraitementaprèsImage représentative des cellules et masque d'analyse comme illustré1Montré. vérifierMesurerChloroquine et vérapamilCellules après traitementLa concentration de la réaction, et d'évaluerCE50Valeur. Nombre total d'autophagosomesLes données montrent,Le traitement à la chloroquine et au vérapamil permetLes cellulesNiveaux d'autophagie augmentés séparément4.6Multiple et3.3Le multiple(CE50Les valeurs sont respectivement4.0et3.6 μM).

conclusion

Cette méthode est associée àId de la celluleColorantsCombinéIl peut être utilisé pour détecter les particules autophagiques et peut être utilisé pour détecter l'impact des composés développés et quantifiés sur le processus d'autophagie.

RéférenceLittérature

1. 1. Mizushima, N.; Komatsu, M. (2011). Autophagie : rénovation des cellules et des tissus. Cellule. 147: 728–41

2. 2. Mizushima, N.; (2007). Autophagie: processus et fonction, Gens & Dev. 21: 2861-2873