Le développement de vaccins, de la recherche et du développement à la recherche préclinique précoce en passant par la production commerciale, les tests et la libération des lots, implique de nombreuses analyses et tests pour garantir l'efficacité et l'innocuité des produits vaccinaux. L'analyse biologique dans le processus de développement de vaccins est confrontée à des défis tels que la matrice de l'échantillon, le type d'Analyte et l'efficacité du flux de travail, tels que les échantillons de vaccins utilisés pour l'analyse varient considérablement et la large gamme d'Analytes comprend des polysaccharides, des protéines et des Polypeptides, entre autres, qui doivent tous être testés dans différentes matrices. En outre, les vaccins de nouvelle génération impliquent un nombre croissant d'antigènes, par exemple les vaccins contre le VPH (Papillomavirus humain) sont disponibles en plusieurs types tels que bivalent, quadrivalent et trivalent, ce qui augmente considérablement la complexité de la détection. Les immunoanalyses sont souvent utilisées pour déterminer le titre, la pureté et l'efficacité des vaccins, ainsi que leur réponse immunogène chez les animaux et les humains, entre autres, et l'immunoanalyse ELISA basée sur des plaques poreuses est devenue l'une des techniques de référence en bioanalyse des vaccins, y compris la quantification des épitopes antigéniques, l'évaluation des niveaux d'impuretés et la surveillance du titre et de l'immunogénicité dans le développement de vaccins, entre autres. Cependant, un calendrier de projet de plus en plus urgent a incité les chercheurs à commencer à chercher des améliorations dans les performances immunoanalytiques des vaccins, notamment:

Utilisation de plus petites quantités de réactifs précieux tels que des molécules candidates au vaccin, ainsi que des échantillons provenant de petits animaux de laboratoire

La méthode de détection facilite le traitement des échantillons de sérum et de plasma, d'adjuvants contenant de l'aluminium et d'adjuvants oléagineux

Réduire le temps d'opérations pratiques

Réduire le temps de développement des méthodes de détection

Gyrolab ® Le système fournit une solution à ces besoins et offre de nombreux avantages supplémentaires dans le développement de vaccins. La plate - forme ouverte de gyrolab permet le développement rapide de tests pour une grande variété d'ANALYTES, de types d'échantillons et de formulations, et fournit des kits prêts à l'emploi pour de nombreuses applications. Gyrolab à bioaffy ™ La détection immunologique Nano - améliorée dans le CD microfluidique minimise les interférences de plusieurs matrices, et la faible consommation d'échantillons et de réactifs peut répondre aux besoins de la dernière génération de vaccins et de tests sur de petits animaux de laboratoire; L'analyse parallèle de plusieurs Analytes avec des modes à haut débit et automatisés réduit considérablement le temps de travail, peut fournir des données rapidement, répondre à des calendriers de projet difficiles et prendre des décisions plus rapides. Les stations de travail logicielles gyrolab sont conformes à la norme 21 CFR Part 11 et développent des méthodes de détection et des données qui répondent aux exigences de l'environnement réglementaire et permettent un transfert fluide entre les usines pharmaceutiques et les cro.

　　Cet article présente plusieurs cas d'application utilisant le système gyrolab pour améliorer les performances et l'efficacité de la recherche et du développement de vaccins afin d'illustrer les avantages du système gyrolab en utilisation réelle.

Cas 1:Détection d'anticorps spécifiques de l'antigène dans le sérum en 1,5 heure

La détection de la quantité et de la qualité des anticorps produits par les cellules B de la mémoire (MBC) des sujets vaccinés est essentielle pour comprendre comment induire des anticorps protecteurs à vie. La fréquence relative des cellules B mémoires spécifiques de l'antigène sanguin périphérique humain est généralement déterminée par la méthode de dilution limitée en continu (slda) et l'analyse ELISA des surnageants de culture cellulaire, mais cette méthode prend du temps et nécessite beaucoup de matériel expérimental, de sorte que les chercheurs en développement de vaccins et de diagnostics de Novartis ont transféré l'immunoessai ELISA sur le système gyrolab pour augmenter le rendement. L'objectif de l'étude était d'inoculer des souris avec l'antigène de Neisseria (Neisseria) en combinaison avec trois Adjuvants pour déterminer par immunodétection le Sous - type d'IgG produit par les cellules B de la mémoire de souris. Les chercheurs ont testé deux formes de détection:

　　Détection directe (direct Assay),

Pour évaluer: la capacité de l'antigène ① biotinylé à se lier à la colonne d'affinité de la streptomycine dans gyrolab bioaffy Microfluidic CD et à capturer les IgG spécifiques; ② sensibilité à la détection d'anticorps spécifiques de l'antigène dans le surnageant de culture cellulaire; ③ par la courbe de liaison dans gyrolab Viewer, l'affinité pour la liaison d'un anticorps à un antigène spécifique est évaluée.

　　Détection inverse (Reverse Assay),

Utilisé pour évaluer la capacité de l'antigène marqué par fluorescence Alexa à détecter les IgG spécifiques liées à la colonne d'affinité CD.

Essai direct

Figure 1: le test gyrolab et Elisa ont identifié les mêmes échantillons positifs et négatifs dans des surnageants de culture de cellules B de souris testées inoculées avec Neisseria. L'axe y est le titre d'anticorps détecté par gyrolab et les échantillons positifs identifiés par ELISA sont marqués d'une case verte.

La méthode de détection directe gyrolab permet la détection simultanée d'anticorps appartenant à différents sous - types d'IgG dans un échantillon de quelques microlitres.

La détection d'anticorps spécifiques à l'antigène sur le système gyrolab présente de nombreux avantages par rapport à l'ELISA, avec seulement quelques microlitres d'échantillon pour analyser la qualité de la réponse anticorps, c'est - à - dire la quantité relative de sous - types IgG.

Cas 2:Dépistage des réactifs – Comparaison des lots de vaccins pour les tests de libération

L'analyse biologique des vaccins polyvalents est de plus en plus complexe et nécessite le développement d'un grand nombre de méthodes de détection. Étant donné que les vaccins polyvalents contiennent plusieurs antigènes et que des tests de libération doivent être mis au point pour chaque composant antigénique afin d'assurer la dose et l'efficacité, le nombre de tests par produit est multiplié par le nombre d'antigènes. Le Vaccine Analysis Development Group de Merck, aux États - Unis, a mis au point une méthode de détection du gyrolab hautement flexible qui peut réduire au minimum le développement et la consommation de réactifs (tels que des anticorps de détection marqués, etc.) pour les méthodes de détection de vaccins polyvalents. La méthode est basée sur des IgG de chèvre anti - souris biotinylées fixées sur une colonne d'affinité Streptomyces de gyrolab bioaffy CD, l'ajout d'un anticorps de capture spécifique de l'Analyte tel que l'alpha - PS MAB murin est suivi de l'ajout de l'échantillon, puis l'Analyte capturé est détecté avec un deuxième anticorps spécifique de l'Analyte tel que l'alpha - PS PAB lapin et enfin avec Alexa fluor. ® 647 les anticorps d'âne anti - lapin marqués ont été détectés par fluorescence (Figure 3). Cette forme de détection "double sandwich" à 5 couches ne nécessite pas de marquage des réactifs spécifiques à l'Analyte, qui peuvent être facilement remplacés, de sorte qu'un développement minimal est nécessaire pour la détection de vaccins polysaccharidiques et protéiques polyvalents et pour les différences entre lots d'antisérums.

Figure 3. 5 couches "double sandwich" gyrolab forme de détection. PS: Analytes polysaccharidiques

Le test gyrolab a été utilisé pour comparer deux lots d'antisérum testés contre trois antigènes. L'utilisation du module logiciel gyrolab Viewer permet de visualiser la réaction de liaison de chaque point de données sur la colonne d'affinité dans le microcanal CD, ce qui permet de comparer les données à des courbes de puissance plus longues (Figure 4).

Figure 4. Panel A: comparaison des lots d'antisérum avec les antigènes a, B et C en utilisant les données d'intensité de fluorescence (à gauche) et les courbes de réaction (à droite). Panel B: image de la courbe d'intensité de liaison de gyrolab Viewer pour l'antigène B montrant une faible intensité de fluorescence sur colonne et une augmentation de la traînée de crête pour le nouveau lot, ce qui suggère que ce lot a une affinité d'anticorps plus faible que l'ancien lot.

Alors que les deux lots ont montré des performances similaires pour l'antigène a, l'ancien lot a montré de meilleures performances pour l'antigène B, avec une plus grande surface de crête combinée au spectrogramme dans gyrolab Viewer et un rapport signal / bruit plus élevé au titrage. Les nouveaux lots montrent une traînée fluorescente marquée sur colonne, ce qui indique une faible affinité pour l'antigène. Pour l'antigène C, les deux lots d'antisérums ont montré un phénomène de traînée prononcé et les anciens lots d'antisérums ont montré plus de traînée de crête. Lors du titrage, le fond de l'ancien lot est élevé et le bruit signal est faible. Par conséquent, la combinaison des spectres de liaison visuels, des courbes de réponse et du rapport signal sur bruit de gyrolab Viewer fournit une opinion précieuse pour comprendre les lots d'antisérum.

L'équipe de Merck a conclu que le système gyrolab fournit des données statistiques et graphiques précieuses qui, lorsqu'elles sont évaluées ensemble, sont cohérentes avec les données de détection basées sur des plaques poreuses, ainsi que des avantages supplémentaires tels que des délais d'exécution rapides, des débits élevés et la capacité de visualiser la force de liaison.

Cas 3:Gamme dynamique quantitative du titre d'antigène élargie à 4 logs

Les sociétés de développement de vaccins doivent élargir la dynamique des immunoessais pour mesurer les antigènes de glycoprotéines adsorbés sur des adjuvants d'aluminium. Les chercheurs ont transféré ELISA sur le système gyrolab, étendant la plage dynamique de 5 - 300 Mui / ML à ~ 0,6 - 40 000 Mui / ML, et la détection gyrolab a étendu simultanément les limites supérieure et inférieure de la quantification.

Figure 5. Gyrolab offre une méthode de détection puissante qui élargit considérablement la plage dynamique lors de la mesure des titres antigéniques.

Cas 4:Essais d'efficacité des vaccins à l'appui du développement de formulations

L'évaluation de la cohérence de l'efficacité entre les lots est un élément important du contrôle de la qualité des vaccins. Les essais de puissance peuvent être utilisés pour des études de stabilité, la validation et l'optimisation des processus de fermentation et de purification, la comparaison des installations anciennes et nouvelles et l'évaluation des effets des modifications de formulation ou d'adjuvant.

Merck, États - Unis, a comparé la performance du système gyrolab à celle du test luminex dans un test de puissance chez la souris. L'étude a impliqué l'immunité in vivo chez la souris, diluant des échantillons d'antigène normalisés dans une gamme de 6 à 12 concentrations de dose. La dose efficace (de50) a été déterminée en fonction de la dose maximale de séroconversion de 50% des souris de chaque groupe d'administration, et jusqu'à 220 échantillons de sérum de souris ont été nécessaires pour obtenir une valeur de de50, de sorte que ce travail fastidieux nécessite un grand nombre d'échantillons de petite taille. Le test gyrolab s'est avéré fiable et robuste, avec une sensibilité et une reproductibilité (CV < 10%) comparables à celles du test luminex (r2 = 0,97), mais avec des temps de fonctionnement plus courts et des délais d'exécution plus rapides.

Figure 6. La détection gyrolab est hautement reproductible, CV<10%

Figure 7. Immunotests avec gyrolab et luminex donnent des résultats comparables