L'alpha - mélanostimuline (alpha - MSH) est responsable du déclenchement de la production de mélatonine, la protection naturelle du corps contre les rayons ultraviolets (UV). L'exposition de la peau aux rayons UV favorise la production d'alpha - MSH; Cependant, stimuler la biosynthèse de la mélatonine avant l'exposition aux UV peut prévenir le cancer de la peau induit par les UV.

Étant donné que la forme naturelle de l'alpha - MSH est trop instable dans le corps pour être administrée en tant qu'agent thérapeutique, différents analogues ont été synthétisés, dont l'un est le Mt - II (Figure 1), un peptide cyclique ayant une résistance élevée et une puissance extraordinaire contre la dégradation enzymatique.

Figure 1

　　Étant donné que la production de mi - II nécessite souvent une mise à l'échelle au niveau kg pour répondre aux besoins cliniques, l'optimisation des conditions du procédé à l'échelle du laboratoire doit tenir compte de la possibilité d'amplification du procédé.

　　

　　Gyros Protein Technologies fournit des synthétiseurs de Polypeptides du laboratoire au niveau pilote pour faciliter l'amplification en douceur de la phase de développement du processus à la production commerciale.

Ce cas traitera de l'optimisation et de l'amplification des voies de synthèse entièrement automatisée, à savoir la synthèse de séquences linéaires et l'endoamidation sur résine du peptide final. Dans ce travail, l'optimisation de la synthèse à grande échelle de MT - II a été réalisée en trois étapes:

　　1Trouver un schéma de protection approprié pour la cyclisation sur résine;

　　2Optimisation des conditions de synthèse et cyclisation complète à petite échelle avec purepep Chorus, fonctionnement entièrement automatique de l'instrument;

　　3Sur le synthétiseur pilote purepep Sonata +, la synthèse MT - II a été amplifiée avec des conditions préalablement optimisées.

　　01Trouver le bon schéma de protection de cyclisation sur résine

La structure du MT - II est achevée après formation d'un pont lactame entre l'acide aspartique et la lysine et ces résidus doivent être déprotégés sélectivement avant l'étape de cyclisation sur résine. L'idéal est donc de trouver des groupes protecteurs de chaînes latérales qui peuvent accompagner l'élimination afin de minimiser la difficulté de déprotection. Dans la première étape de cette expérience, la MT - II a été synthétisée en utilisant différentes combinaisons de groupes protecteurs de chaînes latérales:

1Asp (ODmab) / Lys (ivDde)

2Asp (O-2-PhiPr) / Lys (Mtt)

3Asp (OAlly) / Lys (Alloc)

Ils peuvent être éliminés simultanément et sélectivement respectivement par une solution de DMF à 2% d'hydrazine, par une solution de DCM à 1% de TFA et par une solution de palladium tétrakis (triphénylphosphine) (PD (PPH 3) 4) et de phénylsilane (phsih) dans le DCM. La pureté brute du peptide final est indiquée dans le tableau 1.

Tableau 1 pureté peptidique brute MT - II synthétisée par différentes combinaisons de groupes protecteurs de chaînes latérales

La pureté peptidique brute obtenue avec la combinaison 2 est la plus élevée lorsque l'on compare les différents protocoles de protection. Cependant, FMOC - ASP (o - 2 - phipr) - Oh est relativement cher et peut ajouter des coûts à la production d'amplification ultérieure. La plus faible pureté peptidique brute obtenue avec la combinaison 1 est attribuée à un mauvais effet de déprotection de l'odmab et de l'ivdde par traitement à l'hydrazine à 2%. De plus, bien que la combinaison 3 présente une pureté brute beaucoup plus faible que la combinaison 2, elle a été analysée principalement en relation avec la formation d'Asparagine. En minimisant cette réaction secondaire, la pureté du peptide brut peut être considérablement améliorée. ASP (oally) / lys (ALLOC) a donc été choisi comme monomère MT - II synthétique et optimisé pour l'étape suivante.

　　02 Conditions de condensation optimisées à petite échelle

Nous avons d'abord étudié DIC et oxymapure pour l'étape de couplage sans pré - activation (4) et pré - activation pendant 5 minutes (5). Comme pour la combinaison 3, ces méthodes conduisent à une diminution significative de la pureté peptidique brute due à la formation d'Asparagine (tableau 2). La MT - II est ainsi synthétisée de manière progressive: le Peptide est synthétisé à his (résine his - D - phe - arg - TRP - Lys (ALLOC)) et la condensation de ASP (oally) est réalisée avec hctu / NMM (6) ou DIC / oxymapure (7). Après condensation de l'ASP (oally), on effectue une microcoupure dans laquelle on n'observe aucune formation d'aspartimide. La pureté brute de ces fragments est de 88,9%.

Tableau 2 pureté de la MT - II synthétisée dans différentes conditions

　　Synthèse de peptides linéaires

La MT - II linéaire est synthétisée sur purepep Chorus à l'échelle de 100 µmol sur résine rink - amide mbha (0,35 mmol / g). La résine est gonflée dans le DMF pendant 2 x 10 minutes avant synthèse. L'étape de déprotection est réalisée avec une solution de Pipéridine DMF à 20% pendant 2x5 minutes et l'étape de condensation avec 5 équivalents d'AA, 5 équivalents de DIC et 5 équivalents d'une solution d'oxymapure DMF (sans préactivation - 4, ou 5 minutes de préactivation - 5) pendant 30 minutes à température ambiante. Pour les fragments 7 et 9, ASP (oally) et nle sont condensés dans les mêmes conditions que 5. Pour les fragments 6 et 8, ASP (oally) et nle ont été condensés avec hctu (5 équivalents) et NMM (10 équivalents) dans le DMF à température ambiante avec un temps de préactivation de 5 minutes et un temps de condensation unique de 30 minutes. L'amine terminale de MT - II est acétylée par une solution d'AC 2 O à 10% dans le DMF pendant 30 minutes à température ambiante.

élimination sélective des groupes protecteurs des chaînes latérales ASP et Lys: la déprotection d'ASP (oally) et Lys (ALLOC) est lavée deux fois 60 minutes à température ambiante avec une solution de 0,2 équivalent de PD (PPH 3) 4 dans 24 équivalents de phsih dans du DCM, puis 3 fois avec du DCM et du DMC chacun.

　　Cyclisation sur résine

La cyclisation sur résine est réalisée avec de la pyroxime (5 équivalents) et du dipea (5 équivalents) en solution dans du DMF pendant 60 minutes à température ambiante.

　　Couper

La résine est lavée 3 fois au DMF et 6 fois au DCM puis séchée 20 minutes. Chaque coupe est effectuée avec un mélange TFA / EDT / h 2 O / tis (94: 2,5: 2,5: 1) pendant 60 minutes à température ambiante puis précipitée dans l'éther.

　　03在 Sonate PurePep + 上放大 MT-II 的合成

Après une synthèse optimisée à petite échelle sur purepep Chorus, le schéma 8 est le schéma optimal. La MT - II a été synthétisée à grande échelle (5 mmol) sur purepep Sonata +.

Selon le procédé et les conditions de synthèse du schéma 8, la MT - II est synthétisée sur purepep Sonata + jusqu'à ASP (oally) [FMOC - ASP (oally) - his - D - phe - arg - TRP - Lys (ALLOC) - résine], après quoi les groupes protecteurs des chaînes latérales sont éliminés sélectivement pour une cyclisation ultérieure de la résine. Après cyclisation, la séquence est complétée par addition de nle et d'acétylation n - terminale. Selon cette stratégie, on obtient une MT - II de pureté brute de 80,2%, ce qui est comparable à la pureté du peptide brut synthétisé à l'échelle de 0,1 mmol sur purepep Chorus.

　　conclusion

● dans le synthétiseur multifonctionnel entièrement automatique purepep Chorus, il est possible de réaliser la synthèse de MT - II à petite échelle et d'explorer et d'optimiser différentes conditions de synthèse, puis de placer en douceur les conditions de synthèse optimales sur purepep Sonata +, l'échelle de synthèse est augmentée de 100 µmol à 5 mmol (une augmentation de 50 fois), ce qui donne une pureté peptidique brute presque constante de 80,1%.

●Grâce à la flexibilité de purepep Chorus, la MT - II est une synthèse entièrement automatisée du début à la fin: du polypeptide linéaire à la déprotection sélective de la chaîne latérale et à la Cyclisation de la résine, différentes conditions de condensation sont sélectionnées à chaque étape et des échantillons extraits par microcoupe en ligne peuvent être testés pendant la synthèse afin d'ajuster les conditions en fonction des résultats expérimentaux. Le transfert en douceur du processus sur purepep Chorus est amplifié sur purepep Sonata + et donne le même résultat.