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　　Optimisation rapide des conditions de synthèse PNA avec purepep Chorus polyvalent et multicanal

Les acides nucléiques peptidiques (en abrégé PNA) sont des analogues de l'ADN avec un squelette polypeptidique et possèdent de nombreuses propriétés physico - chimiques. Le squelette de la chaîne principale du PNA est constitué de n (2 - aminoéthyl) - glycine liée à une base d'acide nucléique par un groupe méthylène carbonyle.

Figure 1: Représentation schématique de la structure de l'acide nucléique peptidique, et liaison à l'ADN

Peptide Nucleic Acid non - ionic Nucleic Acid analogues, parce que le PNA ne porte pas de charge négative, il n'y a pas de répulsion électrostatique entre l'ADN et l'ARN, de sorte que la stabilité et la spécificité de la liaison sont grandement améliorées, la capacité d'hybridation avec les molécules d'ADN ou d'ARN est bien supérieure à celle de l'ADN / ADN ou de l'ADN / ARN, qui se manifeste par une grande stabilité d'hybridation, une excellente capacité de reconnaissance de séquence spécifique, pas d'hydrolyse par les nucléases et les protéa

Les PNA peuvent inhiber l'expression génique en se liant à la complémentation par les ARN. Et dans certaines conditions, il est également possible de favoriser l'expression génique en se liant à une séquence double brin d'ADN par un mécanisme d'invasion de brin. Sur la base des caractéristiques supérieures ci - dessus, les PNA ont été largement utilisés dans de nombreux domaines au cours des dix dernières années, et leur haute affinité et spécificité en font non seulement des agents thérapeutiques, mais également des outils puissants dans l'application du diagnostic.

Avec l'approfondissement continu de la recherche fondamentale sur les PNA et l'émergence continue de nouvelles technologies, les PNA afficheront de meilleures performances et des perspectives d'application plus larges.

　　Les défis actuels

En raison de la polymérisation qui se produit facilement pendant la synthèse et des nombreuses réactions secondaires qui se produisent pendant la déprotection, la synthèse des PNA pose de grands défis. Pour les problèmes de polymérisation aisée, la stratégie habituelle est d'utiliser un excès de réactif dans la réaction de condensation. Mais le prix des réactifs monomères PNA pour la protection n - terminale de synthèse est relativement élevé et cette méthode n'est pas largement utilisée. Par conséquent, des procédés de synthèse relativement rentables doivent être développés pour aider les PNA à réussir leur commercialisation.

　　Optimisation des conditions de synthèse sur purepep Chorus

Dans cet article, nous allons démontrer une optimisation rapide des conditions de synthèse des PNA sur un synthétiseur automatique purepep Chorus.

Le PNA 1 sera utilisé pour les séquences de référence afin d'étudier différents paramètres de synthèse tels que le coefficient d'excès du monomère PNa, le temps de réaction ainsi que la température. Les conditions de pureté les plus élevées pour la synthèse de PNA 1 seront utilisées pour synthétiser 5 autres séquences de longueur et de teneur en purines (adénine et guanine) différentes (voir tableau 1). La pureté est un facteur clé dans l'examen de la synthèse et, en raison de la Grande Barrière spatiale des monomères PNa, la facilité de provoquer une réaction de condensation ne conduit pas entièrement à une faible pureté.

Tableau 1: informations sur les séquences PNA en cause dans ce cas

Le PNA 1 a été synthétisé à l'aide d'un synthétiseur de Polypeptides purepep chorus avec un équivalent synthétique de 25 µmol en utilisant une résine rink - amide mbha avec un degré de substitution de 0,27 mmol / G et en suivant un Protocole de protection orthogonale fmoc / tbu. La déprotection des groupements fmoc sur résine est effectuée à l'aide d'une solution de Pipéridine DMF à 20%, en opérant 5 minutes x 2 fois à température ambiante; La réaction de condensation utilise un système de hctu et de NMM, les détails spécifiques de la réaction sont donnés dans le tableau 2. L'opération de bouchage est effectuée après la fin de la réaction de condensation à l'aide d'une solution d'anhydride acétique à 10% dans le DMF et on laisse réagir 5 minutes à température ambiante. Après la fin de la dernière étape de déprotection, la résine est placée dans le liquide de coupe (TFA: tis: H 2 O = 95: 2,5: 2,5) et la réaction est effectuée pendant 4 heures à température ambiante.

Les opérations ci - dessus peuvent être configurées sur Chorus en fonction des conditions requises sur le logiciel avec différents protocoles, le logiciel calcule automatiquement la quantité de réactif requise, l'instrument fonctionne automatiquement, plus d'économies sur les opérations manuelles et assure que le Protocole d'essai est strictement exécuté.

Tableau 2 Etude des conditions de condensation

L'analyse des données du tableau 2 nous permet de constater que la pureté du produit brut atteint 81% lorsque le nombre d'équivalents réactionnels du PNA est 10 fois supérieur; Cependant, sur la base du prix élevé du monomère FMOC - PNA, la conception ci - dessus n'est pas facilement acceptée. Le coefficient d'équivalence de réaction du PNA est réduit à 4 fois et la pureté du brut produit à 72%. Le coefficient d'équivalence réactionnelle du PNA est maintenu à 4 fois à ce moment - là, la température réactionnelle est portée à 45°C et le temps de condensation est réduit à 5 minutes, la pureté du produit brut chute encore à 61%. On constate que le temps de réaction de 5 minutes est trop court pour la réaction de condensation. Les autres conditions n'étant pas modifiées à ce moment - là, le temps de réaction a été augmenté à 10 minutes seulement (Expérience d) et la pureté peptidique brute a atteint 82%, ce qui est proche des résultats de l'expérience a. L'expérience e a été utilisée pour examiner davantage les conditions de la réaction, le coefficient d'équivalence de la réaction a été ajusté à 2 et 2 réactions d'addition ont été effectuées. En utilisant la même quantité totale de matière première réactionnelle et pour le même temps de condensation, la pureté du produit brut est améliorée de 5%.

Nous avons déterminé les conditions de synthèse en fonction des valeurs les plus élevées de pureté du produit PNA 1 et les quelques séquences restantes seront synthétisées de la même manière que PNA 1 (méthode e). Les résultats sont présentés dans le tableau 3:

Tableau 3: résultats bruts pour la synthèse des 5 PNA restants selon la méthode e

La pureté brute du produit après synthèse des 5 barres de PNA ci - dessus est comprise entre 66 et 91%, de tels résultats étant satisfaisants pour les acides nucléiques peptidiques. Il est intéressant de noter que les produits PNA avec des niveaux plus élevés de purine ont une pureté plus élevée.

Figure 2: chromatogramme de 5 produits PNA acquis par le système UPLC - UV à la longueur d'onde de 210 nm. Le système UPLC est Waters H - class UPLC / ESI - MS et la colonne chromatographique est C18 (1,7 µm, 2,1 x 50 mm). La phase mobile est une solution de TFA à 0,1% dans l'eau (A) mélangée à de l'acétonitrile (b).

　　résumé

Dans cette littérature d'application, nous discutons en détail des méthodes d'optimisation de la synthèse de PNA à l'aide du système purepep Chorus. Dans un premier temps, nous avons utilisé 10 fois l'équivalent réactionnel de PNA pour condenser la réaction pendant 1 heure à température ambiante, ce qui permet d'obtenir un produit brut d'une pureté de 81%. Nous nous efforçons de réduire la quantité de réactifs utilisés et de minimiser leur impact sur la pureté du brut afin de rendre la réaction plus économique, durable et conforme aux exigences de la chimie verte. Finalement, nous avons développé des méthodes qui réduisent la quantité de réactifs utilisés, sont pures et élevées. L'utilisation de 2 condensations avec 2 fois l'équivalent réactionnel pour chaque addition, la réaction à 45°C pendant 5 minutes, permet d'augmenter la pureté brute du PNA 1 de 81% à 87%. Enfin, la méthode a été appliquée à la synthèse de 5 autres PNA.

Pour les acides nucléiques peptidiques de différentes longueurs et teneurs en purines, cette méthode donne de bons produits. Le synthétiseur de Polypeptides purepep Chorus est un excellent outil pour ce travail, car le Protocole synthétisé peut être adapté de manière flexible au besoin; Par exemple, modifier le coefficient d'équivalence de réaction, le nombre de répétitions, la température et le temps. Dans le même temps, les instruments automatisés et les fonctions de calcul automatique du logiciel aident à réduire les opérations manuelles et le risque d'erreur, et les conditions de synthèse optimisées peuvent être facilement appliquées à d'autres compositions PNA.