L'effet matriciel (matrix effect / Matrix Interference) est l'effet que d'autres substances d'un échantillon peuvent avoir sur la capacité de détecter un Analyte cible et est le plus fréquent dans les tests immunologiques sur des échantillons biologiques tels que le sérum, le plasma, les homogénats de tissus, etc., car de nombreux composants de ce type d'échantillon tels que les glucides, les protéines, les Phospholipides, les métabolites, etc. interfèrent avec la liaison des anticorps à leur cible ou inhibent ou renforcent les signaux, affectant la quantification précise de l'Analyte [1].

Les interférences stromales sont d’autant plus un défi de taille dans les analyses biologiques de la recherche clinique que de nombreux types d’interférences ont déjà été identifiés dans le sérum et le plasma, souvent des substances endogènes telles que les facteurs rhumatoïdes, les anticorps hétérophiles (anticorps produits contre des antigènes mal définis, présentant une faible affinité et une faible liaison), les anticorps humains anti - animaux (Haaa, anticorps de haute affinité produits lorsque le système immunitaire entre en contact avec des anticorps animaux) et d’autres protéines plasmatiques telles que l’albumine, le Lysozyme, le fibrinogène, etc. [2], qui influencent directement la sensibilité, la spécificité et la variabilité de la détection, conduisant à une quantification inexacte des Analytes.

La méthode la plus fondamentale pour réduire l'effet de matrice est la dilution de l'échantillon, mais à condition que les niveaux d'Analyte restent dans la gamme linéaire après la dilution et que la dilution affecte la sensibilité de détection, ce n'est pas une stratégie universelle. L'optimisation du pH du tampon et de la Force ionique contribue également à réduire les interactions non spécifiques. D'autres stratégies pour surmonter l'interférence comprennent l'incorporation de substances qui se lient ou entrent en compétition avec des molécules interférentes, telles que l'élimination passive des anticorps anti - murins humains (Hama) avec un cocktail approprié de sérum animal, l'utilisation d'inhibiteurs d'anticorps hétérophiles tels que les réactifs de blocage hétérophiles (HBR) et Les réactifs inhibiteurs d'immunoglobulines (IIR), ou l'utilisation de F (ab ') 2 ou de fragments monocaténaires (ScFv) dépourvus de fragments FC comme réactifs de capture / détection, etc. [3], mais la plupart de ces méthodes sont gourmandes en main - d'œuvre et coûteuses et ne sont pas pratiques pour des

Pour l'immunodétection basée sur un test de liaison de Ligand (LBA), la réduction du temps d'incubation ou du temps de contact du réactif de détection avec la matrice s'est avérée être l'un des moyens efficaces de surmonter les effets de la matrice [4].Gyrolab ® Le mode de traversée de la colonne d'affinité est réalisé sur CD microfluidisé, ce qui minimise le temps de contact du réactif avec la matrice, minimisant les perturbations de la matrice.Shannon d chilewski et al. [5] de la société Bristol - Myers Squibb utilisant gyrolab ® La plate - forme aborde le problème des interférences stromales dans les études de PK précliniques.

Ce cas est l'observation d'une perturbation de la matrice dérivée d'anticorps humains anti - animaux (Haaa) dans la détection PK d'un certain anticorps pegylé. Au stade de la découverte du médicament, la méthode de détection utilisée pour soutenir les études à dose unique croissante (SDA) est une méthode basée sur la détection par électrochimiluminescence (ECL) avec la molécule cible comme réactif de capture et l'anticorps anti - vk de chèvre comme réactif de détection, avec une dilution de l'échantillon de 50 fois et une limite inférieure de quantification lloq de 80 ng / ML.

Mais lors de la transition de la phase de découverte à la phase de développement, une sensibilité de détection plus faible est requise et la précision et la précision sont maintenues ou améliorées simultanément, et le lloq de la méthode de détection ECL 80ng / ML n'est plus approprié pour soutenir la prochaine phase de recherche pour les trois raisons suivantes:

1 L'équipe de développement s'intéresse à la caractérisation de la demi - vie du médicament à des doses plus faibles et, si les méthodes de détection actuelles sont suivies, les résultats seront

2 on souhaite mesurer la concentration du médicament dans la circulation à une CE50 d'occupation du récepteur de 78 ng / ML;

3 en cas d'immunogénicité, les anticorps anti - médicaments peuvent avoir un effet de clairance sur le médicament, réduisant les niveaux de médicament dans la circulation, de sorte que l'extrapolation de cette méthode de test pour la quantification du médicament à des doses plus faibles sera encore plus limitée.

　Afin d'augmenter la sensibilité de détection et d'étendre le lloq à la quantité requise de 30 ng / ML, l'équipe de recherche a exploré l'adoption du gyrolab. ® Une combinaison de plateformes et de nouveaux réactifs pour développer rapidement de nouvelles méthodes de détection en un temps limité.

D'abord à gyrolab ® Les combinaisons de réactifs de capture et de détection ont été examinées ci - dessus avec un anticorps polyclonal anti - médicament de chèvre comme réactif de capture et un anticorps anti - type particulier de souris comme réactif de détection, une combinaison qui a montré des performances optimales avec une concentration d'anticorps de capture de 100 µg / ML et une concentration d'anticorps de détection de 2500 ng / ML. Utilisation de gyrolab ® Bioaffy 200 CD (volume d'échantillon 200nl) et gyrolab standard ® L'analyse a été effectuée par une méthode en trois étapes (capture - analyte - détection) avec une DMR de 2 pour la dilution de l'échantillon.

Le PbS - t est utilisé comme tampon de dilution (PBS + 1% BSA + 0,05% Tween - 20) et l'échantillon est dilué 2 fois. 6 Tests CD réalisés en 3 jours. Chaque CD comprend une courbe standard et 4 répétitions de 6 niveaux d'échantillons qc. La courbe standard varie de 30 à 2000 ng / ML avec un point d'ancrage de 2500 ng / ML. Les échantillons QC ont été dilués 125 fois dans du sérum humain à 100%, puis 2 fois avec du tampon de détection pour que les concentrations tombent dans la plage de dosage. Le tableau 1 montre que tous les résultats ont une bonne précision et précision de détection.

Des comparaisons parallèles ont été effectuées avec des échantillons dilués séparément avec du tampon PbS - t et du tampon rexxip H breveté par Gyros (Gyros). Étant donné que la méthode de détection contient du monomab de souris, l'anticorps humain anti - murin Hama est une source potentielle d'interférence, tandis que le tampon rexxip H contient des composants neutralisant les anticorps hétérophiles, il devrait être possible d'inhiber les signaux d'interférence matricielle après dilution avec rexxip H.

Vingt échantillons de sérum (sérum nhs1 - 10 chez 10 personnes normales et sérum dps1 - 10 chez 10 personnes malades) ont été analysés pour incorporation dans le médicament à une concentration de 30 ng / ml de lloq, et les 20 échantillons ont également été analysés sans addition. Critères d'Acceptation: 80% des échantillons étiquetés doivent être récupérés à l'intérieur d'un écart de ± 25% par rapport à la concentration nominale et tous les échantillons non étiquetés doivent être récupérés à un niveau inférieur au lloq. Les résultats (tableau 2) montrent qu'un échantillon de sérum humain normal satisfait aux critères d'acceptation cibles après dilution avec du tampon rexxip H. Un échantillon de sérum humain normal n°2 avec un taux de récupération de 252,6% avec du PbS - t et de 25% avec du rexxip H illustre la très bonne élimination des interférences matricielles dans cet échantillon par le tampon rexxip H. Deux de ces échantillons de sérum de la maladie, lorsqu'ils ne sont pas dosés, même avec le tampon rexxip H, ont une concentration de 32 ~ 35 ng / ML. Par conséquent, dans la conception de l'étude chez les personnes atteintes de la maladie, l'expérience d'addition doit être répétée, la lloq étant conçue à 40 ng / ML.

Résumé:

La méthode de détection par électrochimiluminescence (ECL) (lloq 80ng / ML) a été transférée à gyrolab. ® Sur la plate - forme, en utilisant des paires d'anticorps et des tampons optimisés, des résultats de détection plus sensibles ont été obtenus, l'amélioration du lloq à 30 ng / ML pouvant répondre aux exigences de futures études.

Gyrolab ® Le mode de pénétration de la colonne d'affinité de la plate - forme ainsi que le tampon rexxip breveté peuvent minimiser la baisse de précision et de sensibilité des données causée par l'effet de matrice.

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Références:

[1]. Selby C. Interférences dans l'immunoassay. Ann Clin. Biochimie. 36(Pt 6), 704-721 (1999).

[2]. Ana I. Barbosa, Nuno M. Reis. La couverture de surface des anticorps entraîne l'interférence de la matrice dans les immunoassays capillaires microfluidiques. Capteurs ACS 2021 6 (7), 2682-2690.

[3]. Williams K, Erickson R, Fischer SK. Surmonter l'effet matriciel spécifique à la maladie dans un essai pharmacocinétique clinique utilisant une technologie d'immunoassay microfluidique. Bioanalyse, 9(16), 1207-1216 (2017).

[4]. Saloumeh K. Fischer. Technologies d'essai de liaison de ligands: associer le bon outil à votre défi bioanalytique. https://www.bioanalysis-zone.com.

[5]. Shannon D. Chilewski. Traiter les effets de la matrice dans les essais de liaison de ligands par l'utilisation de nouveaux réactifs et de nouvelles technologies. Bioanalyse (2014) 6(8), 1059-1067.