Vésicules extracellulaires (EV) a connu une croissance rapide au cours de la dernière décennie, avec de nombreuses découvertes et rapports sur ses origines, sa pertinence pour la maladie, son diagnostic et son traitement. Dans ces domaines de recherche, la caractérisation complète de l'EV est essentielle et doit couvrir l'analyse monoparticulaire et globale de l'ev, par exemple la taille des particules, le potentiel, la concentration, la distribution granulométrique et la détection des protéines caractéristiques associées à l'ev, telles que cd9, cd63, cd81, Alix et tsg1012 - 5. Si vous souhaitez effectuer une analyse plus approfondie du phénotype de l'ev, vous devez effectuer une analyse phénotypique de l'EV en utilisant des méthodes telles que Western Blotting, Elisa ou monovésicule / immunomarquage holistique.
À l'heure actuelle, il n'y a pas de moyen de détecter les protéines sur des vésicules individuelles avec l'ensembleDistribution granulométriqueCombiné avec la mesure de concentration. Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) est une technique appliquée à la caractérisation de la distribution granulométrique EV. NTA est basé sur l'équation de Stokes - Einstein en traçant les particules individuelles deLe Mouvement BrownPour déterminer la taille des EV individuels et des populations EV. NTA utilise un laser pour éclairer les particules, ce qui permet théoriquement d'obtenir une excitation spécifique des colorants fluorescents et de détecter les EV marqués fluorescents (NTA - FL).Cependant, il n'existe actuellement qu'un petit nombre d'études qui évaluent rigoureusement NTA - fl et qui s'appuient sur des cibles protéiques EV atypiques ou sur des marqueurs immunologiques marqués de manière non spécifique.- Oui.
Université Tufts, États - Unis (Université TuftsLes chercheurs ont rapporté un algorithme optimisé pour l'immunomarquage Fluorescent d'un seul EV pour NTA - FL, rendant le marquage et la détection immunovésiculaires uniques basés sur NTA plus précis avec la distribution granulométrique et l'analyse de la concentration. L'algorithme peut améliorer efficacement la crédibilité des résultats de détection NTA, fournissant un outil puissant pour une étude plus approfondie des fonctions et des mécanismes de EV- Oui.
Dans des études préliminaires, les chercheurs ont découvert que les利用Autorités fiscales nationaleseffectuerEVFluorescence pour analyse de sous - type/Cas où les données dévient de la méthode d'alignement de la lumière diffuséeGénéralement, le rapport de la surface entourée par la courbe de fluorescence (FM) à la surface entourée par la courbe de lumière diffusée (LSM) peut représenter la pureté de EV. Mais ces chercheurs ont constaté au cours de l’analyse que le rapport FM (Ligne bleue) au LSM (ligne rouge) était supérieur à 100% dans les tests 1, 2, 4 (tableau 1, figure 1), ce qui indique une pureté EV supérieure à 100%, ce qui est clairement déraisonnable.1. Au cours de la détection de fluorescence, un grand nombre de faux signaux peuvent apparaître.
2. Les limitations techniques du système NTA font que le LSM ne peut pas détecter de très petites EV ou d’autres particules à faible indice de réfraction.Ev n'est pas entièrement détecté en mode lumière diffusée, il y a une partie des données EV qui ne sont pas détectées, de sorte que la surface LSM est faible, ce qui conduit à un rapport supérieur à 100%.
Les chercheurs ont également constaté que le mode FM a également des pics de signal distincts dans les zones inférieures à 50 nm, tandis que le mode LSM a une atténuation fondamentale du signal de 0 en dessous de 50 nm, ce qui peut également être l'une des raisons pour lesquelles le rapport est supérieur à 100%.Plus précisément, il peut s'agir de molécules fluorescentes libres qui ne sont pas suffisamment éliminées et de protéines libres du système marquées par des molécules fluorescentes, ce qui entraîne une augmentation du signal de fluorescence dans les partitions de petite taille.
Tableau 1 Rapport de la surface de fluorescence (FM) à la surface de lumière diffusée (LSM) pour différents échantillonsFigure 1 Résultats des tests NTA en mode FM et LSM pour différents échantillons
Pour remédier à cette situation, les chercheurs ont proposé deux méthodes d’évaluation:
La première méthodeEst la méthode de calcul traditionnelle qui calcule le nombre de particules supérieures à 50 nm dans un échantillon et compare le nombre de particules dans FM et LSM pour obtenir la proportion entre FM et LSM. (Figure 2B, c)
La deuxième méthodeEst une méthode de calcul optimisée qui calcule la zone de chevauchement entre les courbes de distribution granulométrique résultant des deux méthodes et compare cette zone avec le nombre total de particules supérieures à 50 nanomètres dans le LSM pour obtenir la proportion de zones de chevauchement. (figure 2d)
Au cours de l'étude, les chercheurs ont mis l'accent sur leur choix de la taille des particules. Pour analyser EV plus précisément, les chercheurs ont réduit leur analyse à50 - 200 nanomètres. Cette gamme a été choisie parce queLa plupart des EV sont dans cette gamme de tailles. En outre,LSM a une capacité limitée de détection des particules de moins de 50 nanomètres, alors que les particules de plus de 200 nanomètres peuvent ne pas être EV. Par conséquent, réduire la portée de l'analyse à50 à 200Nano peut efficacement exclure d'autres types de particules, améliorant la précision des résultats d'analyse- Oui.
Figure 2 schéma de l'algorithme d'immunomarquage basé sur NTA
Sur la base de cet algorithme d’optimisation, les chercheurs ont analysé les données des 6 groupes d’échantillons ci - dessus et les résultats ont montré que la pureté EV était tombée à moins de 100%.
Tableau 2 Rapport de la surface de fluorescence (FM) à la surface de lumière diffusée (LSM) (SA) pour différents échantillons après optimisation algorithmique
L'algorithme ci - dessus, utilisant le marquage de points quantiques et la technologie NTA - FL, permet d'identifier et d'analyser efficacement les ve de différents sous - types au niveau d'une seule vésicule et fournit des informations plus précises sur la distribution granulométrique en comparant les résultats du mode de fluorescence (FM) et du mode de lumière diffusée (LSM). Cependant, bien que la technologie NTA - fl et les algorithmes d'optimisation puissent être efficaces pour améliorer la précision de l'analyse de sous - type ev, il est également important de reconnaître que la technologie NTA présente certaines limites dans le principe sous - jacent.NTA dans la détection de très petits EV ouLarge distribution de la taille des particulesdeÉchantillons (en particulier les échantillons EV)Il existe une certainedifficultéPar conséquent, alors que la technologie NTA - fl et les algorithmes d'optimisation peuvent améliorer la précision de la distribution granulométrique et de l'analyse de la concentration, laLes goulots d'étranglement technologiques de NTA ne sont pas surmontésL'optimisation ultérieure de l'algorithme et la méthode de marquage par fluorescence peuvent êtreObtenir le bon résultat sur une base erronéeIl faut encore faire preuve de prudence pour ne pas trop s'appuyer sur les données obtenues grâce à cette technologie.Nanocoulter nanogranulomètre adoptePrincipe de Kurt, briser les limites du principe optique, chaque particule poreuse peut être analysée avec précision, réaliser la détection de particules uniques dans le vrai sens du terme, sur une large distribution de tailles de particulesDépartement de dispersionLes échantillons ont un meilleur effet de mesure. Et ne sont pas affectés par l'indice de réfraction de l'échantillon, l'Absorbance et d'autres propriétés optiques, les données ne sont pas adaptées, l'état le plus réaliste de l'échantillon réactionnel.
