< 855 >Méthode de turbidité de la lumière diffusée et méthode de turbidité spécifique de la lumière transmise

1. Présentation

La méthode de turbidité de la lumière diffusée et la méthode de turbidité spécifique de la lumière transmise sont des techniques analytiques basées sur le principe du phénomène de diffusion de la lumière. La diffusion de la lumière est un phénomène physique dans lequel un faisceau lumineux change de direction de propagation (appelée déflexion) en raison de son interaction avec des particules de matière suffisamment petites. Selon la théorie électromagnétique de Maxwell, la condition préalable pour que la diffusion se produise est que l'indice de réfraction des particules en suspension doit être différent de celui du liquide en suspension. Plus la différence est grande, plus la diffusion est intense. Il existe deux types de diffusion de la lumière:1), la diffusion élastique, dans laquelle les longueurs d'onde de la lumière diffusée et de la lumière incidente sont identiques;2), diffusion de la lumière non élastique, dans laquelle les longueurs d'onde de la lumière diffusée et de la lumière incidente sont différentes. Seule la première diffusion de la lumière (élasticité) est liée à la méthode de turbidité de la lumière diffusée et à la méthode de turbidité spécifique de la lumière transmise.

Dans la méthode de turbidité spécifique de la lumière transmise, l'intensité de la lumière transmise est mesurée et dans la direction de la lumière incidente (i.e.0°) mesure de l'atténuation de l'intensité lumineuse incidente due à la diffusion et comparaison avec l'intensité lumineuse incidente (mesure à blanc). La caractéristique mesurée est une mesure indirecte de l'effet de diffusion des particules en suspension, appelée turbidité. Toute absorption de lumière par l'échantillon en suspension entraîne une atténuation supplémentaire de l'intensité lumineuse (cf.<857> Spectroscopie visible ultravioletteet<1857> Spectroscopie visible ultraviolette - théorie et pratique). Il est donc important de s'assurer que le matériau mesuré n'absorbe pas la lumière à la longueur d'onde mesurée. En pratique, les équations contrôlant l'absorption et la détermination de la turbidité sont identiques (bien que les valeurs des constantes d'atténuation soient différentes). Dans la méthode de turbidité de la lumière diffusée, la mesure est faite avec la direction de propagation de la lumière incidente90Intensité lumineuse diffusée pour l'angle°. La mesure de turbidité par turbidimétrie à lumière diffusée est donc une mesure directe de l'effet de diffusion des matières en suspension.

2. Termes et définitions

Les termes couramment utilisés pour décrire la méthode de turbidité et la méthode de turbidité comprennent:

•Turbidité (symboleS): mesure de la diminution de l'intensité du faisceau incident transmis due à l'effet de diffusion de la lumière des particules en suspension. La quantité de matières en suspension peut être mesurée en observant la lumière transmise (turbidité spécifique) ou diffusée (turbidité).

journal I₀/ I_t= kbc = T

Je₀=Intensité lumineuse incidente

Je_t=Intensité lumineuse transmise

c=Coefficient molaire de turbidité

b=Longueur du chemin de la piscine d'échantillons

c=Concentration

T=Turbidité

•Turbidité (symbole,τ): dans la mesure de la turbidité de la lumière transmise, la turbidité est l'intensité du faisceau incident pour une suspension donnée/Mesure de la réduction de la longueur unitaire. L'Organisation internationale de normalisation définit la turbidité comme « une diminution de la transparence des liquides due à la présence de substances non dissoutes».«.

•Unité de mesure de la turbidité: l'unité de turbidité est représentée par un descripteur indiquant la méthode de mesure.

•Turbidimètre à lumière diffusée unité de turbidité (NTU): lorsque la turbidité est mesurée à l'aide de la méthode de turbidité de la lumière diffusée, le turbidimètre est orienté vers la direction de propagation de la lumière incidente90°L'angle de l'angle mesure la lumière diffusée, l'unité de turbidité est appelée méthode de turbidité de la lumière diffusée unité de turbidité (NTU).NTULes grandeurs sont définies en fonction de la turbidité produite par le standard de formazide primaire, une suspension réalisée en mélangeant dans l'eau une solution de sulfate d'hydrazine et d'hexaméthylènetétramine. Des suspensions de microbilles de polymère plus sûres sont maintenant disponibles et * sont des alternatives acceptables. Cependant, tous ces critères remontent à la formazide. La turbidité de la solution standard de formazide primaire est4000 NTU- Oui.

Les autres * unités de turbidité comprennent les unités de turbidité spécifique formazide (FTU), et l'unité de turbidité formazide (FNU). Ces unités sont équivalentes à0 à 40 NTUDans la gammeNTU- Oui.

3. Application

Les applications des techniques de turbidimétrie spécifique à la lumière transmise et de turbidimétrie à la lumière diffusée comprennent1), la solution et/Ou la détermination de la concentration de la suspension (détermination de plusieurs cations et anions par précipitation et mise en suspension du précipité produit sous des paramètres réactionnels bien contrôlés);2), mesurer la turbidité d'une solution ou d'une suspension turbide;3) Détermination du poids moléculaire dans1000à la masse moléculaire moyenne en poids et à la taille du système polydispersé entre des centaines de millions;4), la mesure de la cinétique de réaction ou de la cinétique d'immunoprécipitation de l'immunoanalyse (méthode de turbidité par diffusion proportionnelle);5), surveiller la croissance des cellules et des bactéries;6), détermination de la distribution granulométrique des matières en suspension, comptage des particules, etc.

La méthode de turbidité par diffusion proportionnelle est largement utilisée pour l'analyse de la composition des vaccins et/Ou la quantification des composants sériques. Il est également utilisé pour l'identification des protéines des cellules hôtes en biopharmaceutique recombinante. Lorsque cette technique est utilisée, en mesurant l'antigène-Modification de la réaction de diffusion de la lumière d'un complexe d'anticorps purifié d'antisérum ou d'antigène pour calculer les anticorps immunitaires-Antigène de la réaction de précipitation d'antigène ou de la réaction d'agglutination (Ag), ou des anticorps (Ab) La quantité. On considère généralement que l'antigène est lié de manière covalente ou adsorbé sur des microsphères de polymère pour améliorer l'efficacité de diffusion; La technologie qui en résulte est appelée“Analyse immunologique renforcée par particules« etBien que cette technique soit connue sous le nom de méthode de turbidité de la lumière diffusée, la lumière diffusée et la lumière transmise sont généralement mesurées à l'aide d'instruments de mesure de rapport.

Les mesures de turbidité par la méthode de la lumière diffusée sont plus fiables dans la plage de faible turbidité (concentration relativement faible du milieu diffusant). Dans cette plage, on observe la concentration de l'échantillon par rapport à l'intensité du signal du détecteur (pourNTUReprésentation) ont une relation linéaire entre eux. À mesure que la concentration augmente, l'angle d'incidence de la diffusion multiple augmente également, ce qui dévie de la réponse linéaire. Supporte un maximum de relations linéaires fiablesNTULa valeur est dans1750-2000 NTUDans la portée. La méthode de turbidité spécifique à la lumière transmise convient à des gammes de turbidité plus élevées (concentration du milieu diffusant). Pour obtenir des résultats cohérents, toutes les variables mesurées doivent être soigneusement contrôlées. Dans la mesure du possible, des suspensions extrêmement diluées peuvent être mesurées.

4. Instruments instruments instruments

Les instruments utilisés pour la mesure par turbidimétrie spécifique à la lumière transmise et par turbidimétrie à la lumière diffusée sont appelés respectivement turbidimètres à lumière transmise et turbidimètres à lumière diffusée. Généralement, ces instruments comprennent une lampe au mercure avec un filtre (pour une ligne verte ou bleue forte), un obturateur, un ensemble de filtres neutres de transmittance connue et un photomultiplicateur sensible qui peut être monté dans le sens de propagation de la lumière incidente.0°ou90°La position de l'angle, ou sur un bras, il peut tourner autour de l'unité de solution et est réglé par le cadran à l'extérieur du boîtier étanche à la lumière- 135°à0°à+ 135°N'importe quel angle. Les piscines de solution ont des formes variées, par exemple pour la mesure90°Le carré de diffusion;45°、90°et135°La diffusion est semi - octogonale; La forme cylindrique peut être adaptée à la diffusion sous tous les angles (voir photo1).

Figure1.Turbidimètre représentatif. Attention, le détecteur2Peut être monté sur un bras mobile- Oui.

La turbidité peut également être mesurée à l'aide d'un photofiltre standard ou d'un spectrophotomètre, de préférence avec éclairage dans la partie bleue du spectre. La mesure par turbidimétrie de la lumière diffusée nécessite un instrument équipé d'une photocellule pour recevoir la lumière diffusée au lieu de la transmettre. Comme il s'agit de la même géométrie que celle utilisée dans les fluorimètres, on peut l'utiliser comme turbidimètre en choisissant convenablement les filtres. Le turbidimètre ratio combine90°Méthode de turbidité de la lumière diffusée et méthode de turbidité spécifique de la lumière transmise. Il contient des photocellules, reçoit et mesure avec l'échantillon90°Lumière diffusée pour les angles, et lumière diffusée vers l'avant devant l'échantillon reçu et mesuré. Il mesure également la lumière qui traverse directement l'échantillon. Par90°La mesure de la lumière diffusée angulairement, la somme de la mesure de la lumière diffusée vers l'avant et de la mesure de la lumière transmise, le calcul du rapport des deux, la linéarité peut être obtenue. L'avantage d'utiliser un système de mesure de turbidité proportionnelle est que la mesure de la lumière parasite devient négligeable. De plus, la détermination de la turbidité des suspensions colorées est effectuée uniquement à l'aide d'un turbidimètre ou d'un turbidimètre (en mode proportionnel) par turbidimétrie spécifique à la lumière transmise, car cette procédure compense l'atténuation de la lumière due à la couleur de la suspension. Généralement, la source de lumière dans ces instruments est une lampe au tungstène, qui est2700 KLa température du filament fonctionne, la plupart de l'intensité lumineuse est d'environ550 nm. d'autres sources lumineuses appropriées peuvent également être utilisées. Généralement, les détecteurs sont▲Diode de silicium▲Et un tube photomultiplicateur. Une autre façon d'éliminer l'effet de couleur consiste à utiliser comme source lumineuse une diode électroluminescente infrarouge dont le Centre d'émission maximal est d'environ860 nm, la bande passante spectrale est60 nm- Oui.Lorsque des sources de lumière laser sont également utilisées, notamment dans les instruments de mesure de turbidité, cette technique est souvent appelée“Mesure de turbidité au laser« et. L'avantage de l'utilisation d'un turbidimètre à lumière diffusée par laser est que le rapport signal / bruit est considérablement amélioré à des niveaux de détection très faibles. Habituellement, la source de lumière est la longueur d'onde de fonctionnement estde 660 nmLa diode laser. La densité de puissance élevée du faisceau laser permet aux particules plus petites de produire une intensité de diffusion plus élevée. Combiné à un piège à lumière qui absorbe la lumière non diffusée, le système réduit considérablement la lumière parasite. Lorsqu'un programme dans une monographie indique l'utilisation d'un turbidimètre à lumière diffusée ou d'un chronomètre à lumière transmise, un instrument fonctionnant en mode ratio peut être utilisé.

5. Norme de turbidité formazide

Formazide est actuellementPrincipaux critères de turbidité connus. Tous les autres critères sont secondaires et doivent être retracés à la formazide.Les principaux critères sont en▲IUPAC Compendium de terminologie chimique▲ (ERR 1-mai-2019）第 2 Edition (livre d'or) est défini comme un standard préparé par l'utilisateur à partir de matériaux traçables en utilisant des méthodes et des conditions clairement définies.

Les suspensions de formazide ont de nombreuses caractéristiques pour assurer leur adéquation en tant que critère principal. Il peut être préparé de manière cohérente et précise à partir de matières premières de qualité réactif. Cette suspension est constituée de polymères de différentes longueurs et configurations aléatoires, les polymères qui la composent ayant des formes et des dimensions allant de moins de0,1 μmà plus de10 μmPas varié. Bien qu'il ait été démontré que la distribution des longueurs de chaîne du polymère varie d'une préparation à l'autre, les résultats totaux de turbidité peuvent être bien reproduits.

5.1 Préparation des normes de formazinePréparation de la solution standard de formazide

•硫酸肼溶液Pour:Mettre1 000 g d'ACSSulfate d'hydrazine grade (N₂H₄·H₂Alors₄) dissous dans100 mLDeUnDans une bouteille volumétrique et dilué à l'échelle avec de l'eau sans particules. Laisser cette solution reposer4 - 6Heures.

•Liquide standard de formazide primaire:Mettre2,50 gGrade analytique hexaméthylènetétramine[(CH)₂) et₆N₄]Soluble dans25,0 mLEau sans particules, chargée dans100 mLLe flacon. utiliserUnClasse25 mLPipette ajouter25,0 mLSolution de sulfate d'hydrazine et bien mélanger. Avant utilisation, laissez la préparation25±1Laisser reposer à la température de°48Heures. La suspension ainsi produite peut fonctionner de manière stable2Mois.

•Suspension Standard stock de formazide1Pour:utiliser15 mL APipettes, qui seront15 mLFormazide liquide standard primaire transféré à1 litreDans une bouteille jaugée et diluer à l'échelle avec de l'eau sans particules et mélanger. La turbidité de la suspension obtenue est60 NTU- Oui.

•Suspension Standard stock de formazide2Pour:utiliser50 mL APipettes, qui seront50 mLFormazide liquide standard primaire transféré à200 mLDans une bouteille jaugée et diluer à l'échelle avec de l'eau sans particules et mélanger. La turbidité de la suspension obtenue est1000 NTU- Oui.

•Suspension de référence de formazide:Selon le tableau1, dans100 mLOn prépare une suspension de référence de formazide en mélangeant chaque partie de la suspension étalon stock de formazide et de l'eau sans particules dans une Fiole jaugée.