Un,PCR entièrement automatiquePréparation avant l'opération

Préparation des réactifs et des consommables

Réactifs: comprend des matrices d'ADN, des amorces spécifiques (avant et arrière), des dNTP (quatre désoxyribonucléotides), des polymérases d'ADN résistantes à haute température (telles que l'enzyme TAQ), des tampons et des solutions d'ions mg². Tous les réactifs doivent être mélangés après la fusion complète, évitant les erreurs de concentration.

Consommables: utilisez un tube PCR stérile jetable ou une plaque 96 puits pour assurer une bonne étanchéité et prévenir la contamination croisée.

Opérations de zonage: Terminez la formulation du système dans la zone de préparation des réactifs (table de travail ultra - propre ou armoire de biosécurité), portez des gants et évitez de parler pendant l'opération, réduisez la pollution par les aérosols.

Inspection des instruments

Confirmez que le PCR est placé sur une plate - forme robuste horizontale avec une tension d'alimentation adaptée et une bonne mise à la terre.

Vérifiez que la cuve d'échantillon est propre et évitez que les résidus n'affectent la conduction de la température.

Nettoyez régulièrement la cuve d'échantillonnage avec de l'eau savonneuse et interdisez l'utilisation d'alcalis forts, d'alcool à haute concentration ou de solvants organiques.

II. Formulation du système réactionnel

Mélange de réactifs

Les matrices d'ADN, les amorces, les dntps, l'ADN polymérase, le tampon et la solution de mg² sont ajoutés proportionnellement dans un tube de centrifugation stérile avec la quantité appropriée de distillation à double vapeur jusqu'au volume final (recommandé 15 - 50 μl).

Paramètres clés:

Qualité du gabarit ADN: éviter la dégradation ou la contamination par inhibiteur, sinon affecter l'efficacité de l'amplification.

Conception de l'amorce: assurer la spécificité, éviter les structures dimères ou auto - complémentaires, la température de recuit doit correspondre à la valeur de TM de l'amorce.

Concentration en mg²: trop élevée ou trop faible inhibe l'activité enzymatique et doit être ajustée selon les instructions des réactifs.

Système de sous - assemblage

Le mélange est rapidement divisé dans le tube PCR, le couvercle du tube est fermé ou recouvert d'un film spécial et une courte centrifugation (1000 - 2000 tr / min, 1 min) permet au liquide de couler au fond du tube.

Iii. Paramètres du programme PCR

Paramètres du programme de température

Dénaturation initiale: 94 - 98°c, 20 - 30 secondes, permettant la séparation complète des doubles brins d'ADN.

Dénaturation cyclique: 94 - 98 ° C, 20 - 30 secondes, maintien de l'état monocaténaire.

Recuit: 50 - 65 ° C, 20 - 40 secondes, les amorces sont spécifiquement liées au gabarit (la température de recuit doit être optimisée par PCR Gradient).

élongation: 72°C, 1 min / kb de fragments d'ADN, synthèse de nouveaux brins par l'enzyme Taq.

Nombre de cycles: 20 - 40, ajusté en fonction de l'abondance du fragment cible.

Extension finale: 72 ° C, 5 - 10 minutes, en s'assurant que tous les segments sont complètement étendus.

Température de conservation: 16 ℃, 2 minutes (éviter la consommation excessive du compresseur, interdire le réglage à 4 ℃ pour une conservation illimitée).

Paramètres fonctionnels avancés

Gradient de température: réglez le gradient de température (par exemple 50 - 65 ° c) pendant l'étape de recuit, testez plusieurs températures de recuit en même temps, optimisez les conditions expérimentales.

Vitesse de réchauffement (Ramp rate): ajustez la vitesse de réchauffement / refroidissement (par exemple 3 ° C / s) pour réduire le temps de réaction.

Incrément cyclique: Incrémentation de la température ou du temps après chaque cycle (par exemple, 0,1 ° C de réchauffement par cycle) pour des expériences spéciales telles que la PCR Touchdown.

Sauvegarde et fonctionnement du programme

Enregistrer après avoir entré le nom du programme, placez le tube PCR dans la fente d'échantillon, fermez le couvercle chaud et serrez.

Démarrez le programme, la température et l'heure peuvent être surveillées en temps réel à travers l'écran pendant l'exécution, soutenir la pause, sauter des étapes ou arrêter le programme.

Iv. Post - traitement expérimental

Analyse des produits

Le tube PCR est retiré immédiatement après la fin de la réaction et la taille et la concentration du produit sont analysées par électrophorèse sur gel d'agarose ou par détection par fluorescence comme sybr Green.

Si vous utilisez la méthode de marquage par fluorescence, assurez - vous que les paramètres de l'instrument (tels que la longueur d'onde d'excitation, la valeur du gain) correspondent aux réactifs pour éviter les interférences de signal de fond.

Maintenance des instruments

Avant d'éteindre l'instrument, le module à chauffer est naturellement refroidi à la température ambiante, ce qui empêche les dommages causés par le stress thermique.

Calibrez régulièrement le capteur de température pour assurer la précision de la température (par exemple, en utilisant un étalon de point de fusion standard).

Nettoyez la rainure d'échantillon et le couvercle chaud, vérifiez si la bague d'étanchéité vieillit et Remplacez les pièces perdues à temps.

Cinq,PCR entièrement automatiquePrécautions

Prévention et contrôle de la pollution

L'expérience suit le principe « sans acide nucléique» tout au long de l'expérience, en utilisant des pipettes spéciales, des têtes de pistolet et des vêtements de travail pour éviter la contamination croisée.

Mettre en place un contrôle négatif (sans gabarit) et un contrôle positif pour surveiller la fiabilité du système expérimental.

Opérations de sécurité

Évitez d'ouvrir le couvercle chaud pendant le fonctionnement de l'appareil PCR pour éviter les brûlures à haute température ou l'évaporation de l'échantillon.

Il est interdit d'utiliser des liquides corrosifs pour nettoyer l'instrument et éviter d'endommager les composants électroniques.

Vérification des défauts

Aucun produit d'amplification: vérifier la qualité du gabarit, la conception des amorces ou les paramètres du programme (p. ex., température de recuit trop élevée).

Bandes non spécifiques: optimisation de la température de recuit ou augmentation du temps d'allongement, diminution de la formation de dimères.

Fluctuations de température: contactez un ingénieur pour étalonner l'instrument et vous assurer que l'uniformité de la température est conforme à la norme (par exemple ± 0,2 ° c).