Préface

Les couplages anticorps - médicaments à petites molécules (ADC) sont une classe de produits biologiques thérapeutiques qui reconnaissent avec précision les cellules ciblées par des anticorps, libérant des médicaments à petites molécules couplés après leur entrée dans les cellules ciblées par endocytose, ce qui permet d'atteindre l'objectif de l'élimination précise des cellules ciblées et de minimiser la destruction des cellules normales. En raison du principe de conception de l'ADC, sa métaphore figurative est "biomissile", le premier médicament ADC depuis 2000 mylotarg ® Après l'approbation de la FDA [1], 19 ADC ont été approuvés pour la commercialisation dans le monde en juin 2025. Après avoir franchi la barre des 10 milliards de dollars pour la première fois en 2023, les ventes mondiales d’adc ont continué de dépasser les 10 milliards de dollars en 2024, poursuivant ainsi une forte dynamique de croissance.

Dans le top 10 mondial des ADC en 2024, kadcyla (enmetrocytol, herselay) de roche occupe la deuxième place. Le médicament a été approuvé pour la commercialisation par la FDA en 2013 pour le traitement du cancer du sein HER2 - positif, avec des ventes mondiales d’environ 2,3 milliards de dollars en 2024. L'enmétrastuzumab est un ADC ciblant HER2 contenant du Trastuzumab IgG1 humanisé anti - HER2, qui se lie de manière covalente au dm1 (dérivé de la métacine), un médicament inhibiteur des microtubules, par l'intermédiaire du MCC (4 - [n - maléimidométhyl] cyclohexane - 1 - carboxylate), un Ligand Thioéther stable, avec une distribution de poids moléculaire allant de 147 à 158 kDa et un rapport de couplage médicament / monothérapie (DAR) de 0 à 8 avec un Dar moyen d'environ 3,5 [3]. En raison de la complexité de sa structure, sa caractérisation peut sembler difficile. Dans l'étude de cet article, nous utilisons ce qui vient d'être publié lors de la Conférence annuelle américaine sur la spectrométrie de masse (ASMS) de cette année.Nouveau spectromètre de masse 2 - en - 1 ultra haute résolution excedion pro biopharmaLa caractérisation complète de kadcyla a démontré les excellentes capacités analytiques de la plateforme dans le domaine biopharmaceutique, en particulier la fonction de fragmentation par collision assistée par dissociation par transfert d’électrons (ethcd), qui contribue à l’identification précise des sites de couplage des médicaments, et l’identification des modifications post - translationnelles (PTM).

Points forts de l'application

Comme indiqué précédemment, excedion pro biopharma, une nouvelle génération de Spectromètres de masse 2 - en - 1 à très haute résolution, récemment lancée cette année, a été utilisée pour la caractérisation en profondeur de kadcyla. Les points forts de l'instrument comprennent, mais ne sont pas limités à, l'extension de la gamme de détection de masse à M / z = 12 000 da (configuration biopharma option requise), la capacité de répondre à la détermination du poids moléculaire des anticorps monoclonaux monomères / dimères / trimères dans des conditions non dénaturantes, ainsi que d'autres complexes protéiques de poids moléculaire élevé; La fonction ETD en option permet une fragmentation ETD / ethcd rapide et sensible, combinée à la fragmentation par collision à haute énergie (HCD), permettant une couverture complète et riche en séquences protéiques ainsi que des informations d'identification PTM. La structure de l'instrument excedion pro biopharma est illustrée à la figure 1 et la figure 2 illustre le processus de caractérisation en profondeur de kadcyla dans cette expérience.

Figure 1: diagramme structurel d'excedion pro biopharma, la partie mise à jour matérielle par rapport à son prédécesseur est surlignée en bleu. L'option biopharma Edition peut étendre la plage de détection de la qualité jusqu'à M / z = 12 000 da (section boîte verte) et l'option ETD peut permettre la fragmentation ETD / ethcd (section boîte rouge). (cliquez pour l'agrandir)

Figure 2. Organigramme de caractérisation kadcyla.

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Kadcyla détermination du poids moléculaire complet dans des conditions non dénaturantes

La détermination du poids moléculaire complet est un élément essentiel de la caractérisation des médicaments biologiques et, pour les ADC, la valeur moyenne du DAR et la distribution de la charge du médicament (DLD) sont des attributs clés pour juger de la qualité du médicament, en plus du poids moléculaire complet. Dans cette expérience, nous avons effectué une détermination complète du poids moléculaire de kadcyla dans des conditions non dénaturantes. Les conditions non dénaturantes utilisent un système de sels tampons neutres, les molécules de protéines sont plus proches de leur état naturel que les conditions dénaturantes, les protéines sont moins chargées et les pics de spectrométrie de masse entre les états de charge adjacents se chevauchent moins, ce qui réduit les interférences entre les signaux de spectrométrie de masse, contribuant à des résultats de détermination de poids moléculaire complets plus précis. La figure 3 présente les résultats de la détermination du poids moléculaire complet dans les conditions non dénaturantes de kadcyla. Pour rapprocher les échantillons de leur état naturel, nous ne les avons pas soumis à un traitement de désaccharification. Visible par la figure 3a, au niveau du spectrogramme original, les pics de spectrométrie de masse couplés avec différents nombres de médicaments et différents composants glycotypiques ont essentiellement atteint la séparation de base, après déconvolution, une distribution de couplage de médicament de 0 ~ 8 peut être clairement observée (figure 3b), le logiciel biopharma Finder peut calculer automatiquement la valeur moyenne de Dar, la valeur moyenne de Dar de cet ADC est de 3,47 (figure 3c), en accord avec la littérature rapportée 3,5.

(A)

b)

c)

Figure 3. Résultats de la détermination du poids moléculaire complet de kadcyla dans des conditions non dénaturantes. A, Carte spectrale originale et agrandissement partiel. B, Spectrogramme de déconvolution. C, le logiciel biopharma Finder est capable de sélectionner automatiquement les composants pertinents et de calculer la valeur moyenne du DAR. (cliquez pour l'agrandir)

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Fragmentation secondaire ethcd dépendante des données pour l'analyse peptidographique,

Mise en oeuvre du positionnement des sites de couplage ainsi que de la qualification ptm

L'analyse de peptidogramme basée sur la ligature liquide est l'une des méthodes analytiques couramment utilisées dans la caractérisation de produits de type biothérapeutique, permettant la couverture de séquence, la localisation de divers sites chimiquement modifiés et l'analyse quantitative qualitative des modifications post - traductionnelles courantes, entre autres. Dans diverses techniques de fragmentation par spectrométrie de masse, il est largement utilisé dans l'analyse des peptidogrammes en raison de la capacité de fragmentation HCD à produire des ions fragmentés B / y riches après l'interruption des liaisons peptidiques pour l'identification des segments peptidiques. Cependant, pour certains segments peptidiques modifiés, par example les glycopeptides, les segments peptidiques couplés Linker - médicament, etc., l'utilisation de la fragmentation HCD ne permet pas de localiser précisément le site modifié pour les segments peptidiques présentant plusieurs sites potentiels de modification, car la HCD brise le couplage glycoprotéine / Linker - médicament; De plus, pour certains segments peptidiques contenant des acides aminés isomérisés, par example leucine / isoleucine, isomérisation acide aspartique / acide aspartique, etc., il n'est pas possible de les différencier car les ions B / y produits par HCD sont de même masse. Et ETD parce que le mécanisme de réaction est différent, à la fois peut conserver intact la chaîne glycémique, couplage Linker - médicament et d'autres modifications de chaîne latérale tout en fragmentant le squelette du segment peptidique, et pour les acides aminés isomérisés, peut également produire des ions diagnostiques caractéristiques, permettant ainsi l'identification et la différenciation des acides aminés isomérisés. L'ajout de la fragmentation assistée par HCD, ou ethcd, sur la base de la fragmentation ETD permet d'obtenir simultanément les ions B / y et C / Z dans le même diagramme secondaire, ce qui permet d'obtenir des informations plus complètes et plus riches pour la caractérisation des segments peptidiques, en particulier les segments peptidiques modifiés / isomérisés. Équipé d'une option ETD permettant une fragmentation ETD / etchd rapide et sensible, le spectromètre de masse excedion pro 2 - en - 1 à très haute résolution peut définir un mode d'acquisition de données ethcd ms2 (DD ethcd ms2) dépendant des données pour compléter la fragmentation HCD ms2 (DD HCD ms2) dépendant des données afin d'obtenir des informations complètes sur l'analyse du peptidogramme.

Dans l'étude de cet article, nous avons dénaturé kadcyla en utilisant deux protéases, trypsin et aspn, respectivement, et par la suite, pour des échantillons de deux protéases différentes, nous avons tous deux effectué des acquisitions de données DD HCD ms2 et dd ethcd ms2 pour obtenir des informations telles que la couverture de séquence, la distribution des sites de couplage et les modifications post - traductionnelles. À l'aide de DD HCD ms2, les échantillons enzymatiquement lysés par Trypsin et aspn ont permis d'obtenir une couverture de séquence de 100% pour un échantillon injecté (données non présentées). La figure 4 montre un spectrogramme de pic de base (base Peak chromatogramme, BPC) analysé à l'aide de peptidogrammes d'échantillons enzymatiquement lysés par dd ethcd ms2, trypsin et aspn, ainsi qu'un diagramme de couverture de séquence qui peut également atteindre une couverture de séquence de 100% pour un échantillon d'aiguille, démontrant que la fragmentation ETD / etchd du spectromètre de masse excedion pro 2 - en - 1 à très haute résolution peut être compatible avec la chromatographie liquide à débit classique, obtenant un spectrogramme secondaire de haute qualité pour l'analyse peptidogrammique.

Figure 4. Le peptidogramme kadcyla analyse le profil du pic de base et la couverture de séquence, tous deux en mode d'acquisition de données dd etchd ms2. À gauche, trypsin enzymolyse l'échantillon. À droite, l'échantillon est enzymatiquement lysé par aspn. Pour différents échantillons enzymolytiques de protéase, une seule aiguille peut être réalisée avec une couverture de séquence de 100%. (cliquez pour l'agrandir)

Comme indiqué précédemment, le Ligand - médicament de kadcyla (MCC - dm1) est couplé à la lysine par liaison covalente, et le couplage se produit également à l'extrémité n - terminale du Trastuzumab, de sorte que pour l'ensemble de la molécule kadcyla, il y a un total de 92 sites de couplage potentiels, dont 46 sites non répétés (Figure 5). Étant donné que la lysine est couplée de manière covalente pour créer une obstruction stérique, ce qui entraîne des fuites de trypsine, la trypsine enzymolyse produit un segment peptidique couplé Ligand - médicament contenant plusieurs lysines, tandis que la fragmentation HCD brise simultanément le squelette du segment peptidique et le médicament couplé, ce qui rend impossible de déterminer avec précision Le site de couplage du médicament à partir du seul profil secondaire HCD. Alors que l'ethcd, en raison du mécanisme de fragmentation différent, peut conserver les groupes de couplage de médicament tout en fragmentant le squelette du segment peptidique, l'énergie de fragmentation assistée par HCD optimisée peut rendre la fragmentation du segment peptidique plus adéquate tout en préservant au maximum le médicament complètement couplé. Le tableau 1 montre la fragmentation secondaire des échantillons enzymolytiques de trypsine avec HCD et ethcd, respectivement, un résumé des informations obtenues sur les sites de couplage médicamenteux, 43 des 46 sites potentiellement modifiés ont été identifiés avec la présence de modifications médicamenteuses, la fragmentation visible avec ethcd, pour les segments peptidiques contenant plusieurs sites potentiels de couplage, Les sites de couplage peuvent être localisés avec précision, et en combinaison avec les résultats de HCD, des informations complètes et détaillées sur les sites de couplage peuvent être obtenues.

Figure 5: la molécule kadcyla a tous les sites potentiellement modifiés, marqués dans la séquence protéique par des cases rouges, pour un total de 92 sites, dont 46 sites non répétés.

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Tableau 1. Sommaire des sites d'identification kadcyla

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Police rouge, site de couplage. "+ +", le site de couplage peut être confirmé par un ion Fragment secondaire. "+", un couplage est présent sur ce segment peptidique, mais la localisation spécifique du couplage ne peut être confirmée par l'ion Fragment. "-", aucun couplage identifié.

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Lorsque kadcyla est enzymolytique avec aspn, la chaîne lourde produit un segment peptidique d contenant trois lysinesK(216)K(217)VEPL(221)SC， Et les résultats de l'analyse peptidographique de l'échantillon par trypsine enzymatique sont connus que ces trois lysines peuvent être couplées. Le Ligand MCC - dm1 de kadcyla - le médicament contient un centre isomérique (Figure 6, en haut à gauche), ce qui entraîne l'élution des segments peptidiques couplés au médicament sous forme de pics opposés sur chromatographie en phase inverse. Comme le montre la figure 6, le segment peptidique D est dû à la présence de plusieurs sites potentiels de couplage et du Centre d'isomérisation MCC - dm1.K(216)K(217)VEPK(221)Le diagramme xic (Extract ion current) de SC présente plusieurs groupes de pics. Grâce au spectrogramme secondaire informatif produit par fragmentation ethcd, il est possible d'identifier avec précision quel site des segments peptidiques élués avec différents temps de rétention a été couplé (Figure 6, en bas) et de calculer les proportions relatives de chaque modification à partir de la surface du pic xic (Figure 6, en haut à droite).

Figure 6. Identification du site de couplage par ethcd sur un segment peptidique contenant plusieurs sites de couplage. (cliquez pour l'agrandir)

Pour les échantillons d'ADC, diverses modifications post - traductionnelles liées à la qualité du médicament, en plus des sites de couplage du médicament, doivent également être caractérisées et surveillées. La figure 7 représente le fragment peptidique fnwyviso sur la base d'un spectrogramme de fragmentation secondaire ethcd,D(283)Résultats de l'identification de l'isomérisation de l'acide aspartique de gvevhnak. Grâce à la haute sensibilité et à la précision de haute qualité de la plate - forme instrumentale, il est encore possible d'identifier des ions C / z abondants même avec des segments peptidiques isomérisés à des teneurs relatives de seulement 0,18% des segments peptidiques non modifiés, ainsi que des ions C + 57 / Z - 57 caractéristiques produits par l'isomérisation de l'acide aspartique dans la fragmentation ETD, permettant ainsi la confirmation de l'isomérisation de l'acide aspartique. Des résultats relativement quantitatifs peuvent être obtenus pour d'autres modifications post - traductionnelles courantes telles que la désamidification, l'oxydation et la glycosylation, etc. (Figure 8).

Figure 7. Confirmation de l'isomérisation de l'acide aspartique par fragmentation ethcd. L'ion C + 57 / Z - 57 peut être observé sur l'agrandissement local ci - dessous. (cliquez pour l'agrandir)

Figure 8. Autres résultats quantitatifs relatifs des modifications post - traductionnelles courantes, tous des moyennes d'échantillons répétés dd etchd ms2 à trois aiguilles. A, Oxydation de la Méthionine. B, Désamidification de l'Asparagine. C, Asparagine succinimidification. D, Oxydation du tryptophane. E, N - glycosylation des chaînes lourdes. (cliquez pour l'agrandir)

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résumé

Cet article présente les résultats expérimentaux de caractérisation de l'ADC kadcyla couplé à la lysine à l'aide d'un spectromètre de masse 2 - en - 1 ultra haute résolution de nouvelle génération, excedion pro biopharma. La détermination complète du poids moléculaire de kadcyla dans des conditions non dénaturantes, la distribution du nombre de couplages pharmaceutiques 0 ~ 8 peut être mesurée dans des conditions sans désaccharidation, la valeur moyenne de Dar obtenue après traitement logiciel est de 3,47, ce qui est conforme aux 3,5 rapportés; La fragmentation rapide et sensible d'ethcd peut non seulement réaliser la couverture de séquence de 100% d'un échantillon d'introduction unique, l'identification commune de modification post - traductionnelle avec la quantification relative, mais également l'identification de site de couplage, l'identification d'acide aminé isomérisé, etc., fournissant des résultats crédibles pour la caractérisation complète de molécules biologiques complexes.

Références:

[1] Fu, Z., Li, S., Han, S. et al. Conjugé de médicament anticorps: le « missile biologique » pour la thérapie du cancer ciblée. Sig Transduct Target Ther 7, 93 (2022).

[2] https://assets.roche.com/f/176343/x/38d96ed8ec/fb24e.pdf

[3] Joubert, N., Beck, A., Dumontet, C., Denevault-Sabourin, C. Conjugés anticorps-médicaments: la dernière décennie. Produits pharmaceutiques 2020, 13, 245.

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