4 avril 2025, à l'Institut Scripps, Californie, États - UnisProfesseur Kendall W. nettlesetLe professeur John R. Yates III a publié un article intitulé « Native top - down Proteomics enables Discovery in Endocrine - resistant Breast Cancer » dans la revue Nature Chemical Biology.Le texte développe uneStratégie Native top - down Proteomics (ntdp), pour l'identification de complexes protéomiques ≤ 70 kDa dans des cellules cancéreuses du sein, y compris un modèle de résistance endocrinienne surexprimant le récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR), co - identifié104 complexoformes de 17 complexes protéiques(forme d'assemblage spécifique du complexe protéique). L'étude a révélé que l'EGFR peut induire la dissociation de l'assemblage du facteur de transport nucléaire 2 (nutf2), tandis que les sites modifiés K4 et k55 de nutf2 ont un effet différencié sur l'inhibition de la voie de signalisation du récepteur aux œstrogènes (ER). L'étude a révélé la caractérisation moléculaire du Protéome du cancer du sein et le rôle des complexoformes dans la croissance tumorale et la résistance au traitement, offrant de nouvelles perspectives pour comprendre les mécanismes de la maladie et développer des médicaments.

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Un

Contexte de l'étude

Les derniers chiffres publiés par le Centre international de recherche sur le cancer de l’oms montrent que 2,26 millions de nouveaux cas de cancer du sein ont été enregistrés dans le monde en 2020, dépassant les 2,2 millions de cas de cancer du poumon. Le cancer du sein a remplacé le cancer du poumon en tant que premier cancer au monde. Les protéines s'assemblent par des interactions non covalentes pour former des complexes fonctionnels, entraînant la quasi - totalité des fonctions clés associées aux tumeurs malignes telles que le cancer du sein dans la cellule, tandis que les multiples protéoformes produites par les protéines en raison de l'épissage différentiel, des variations de séquence, des modifications post - traductionnelles (PTM) ou des mutations affectent la formation, la stabilité et l'activité de ces complexes fonctionnels. Les approches protéomiques ascendantes traditionnelles ont des limites dans l'élucidation du protéoform produit par des protéines individuelles, la caractérisation des Ligands et des cofacteurs liés aux complexes protéiques et la cartographie des modèles de PTM combinés. La combinaison de la spectrométrie de masse Native (MS Native) et de la protéomique descendante (top down Proteomics) pour former la protéomique Native top down Proteomics (ntdp), bien qu'elle ait des capacités de résolution structurelle, est moins utilisée dans les échantillons biologiques complexes en raison de problèmes tels que la faible abondance de complexes protéiques Dans les échantillons biologiques complexes, les difficultés de séparation des complexes protéiques et le manque d'outils bioinformatiques pour traiter des ensembles de données ntdp à grande échelle. Dans la recherche sur le cancer du sein, la signalisation du facteur de croissance est l'un des principaux mécanismes de résistance au traitement endocrinien, l'amplification du récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR) et les mutations des composants de signalisation en aval étant associées à la résistance clinique au tamoxifène, mais le mécanisme spécifique n'a pas été défini. Par conséquent, le besoin d'une approche efficace pour étudier la caractérisation des assemblages protéiques dans les cellules du cancer du sein afin de comprendre en profondeur les mécanismes moléculaires de la maladie et de concevoir des médicaments efficaces a fourni le contexte et la motivation pour l'élaboration et l'application de la stratégie ntdp dans cette recherche.

deux

Méthodes de recherche

1

Objet de l'étude:

Les cellules du cancer du sein MCF - 7 qui sont positives pour le récepteur des œstrogènes Alpha (erα) (plus tard appelées cellules MCF - 7) et les cellules MCF - 7 qui surexpriment le récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR) (en tant que modèle de résistance à la thérapie ciblée par er, plus tard appelées cellules MCF - 7 - EGFR).

2

Flux de travail ntdp

Le flux de travail ntdp développé par les chercheurs est illustré à la figure 1, en utilisant d'abord la chromatographie d'exclusion de taille Native hors ligne (nsec) pour extraire les complexes protéiques solubles des cellules pour la séparation; Puis par Nano - ESI – faim – msn (Phase liquide: Easy - NLC 1200, unité de séparation de phase gazeuse: faim, spectrométrie de masse: orbitrap fusion Lumos)Une analyse de caractérisation du complexe protéique Native top down; Dernière utilisationProSight NatifLe logiciel combine la correction manuelle pour analyser des données de spectrométrie de masse complexes.

Figure 1: flux de travail ntdp (cliquez pour agrandir l'image)

trois

Résultats de l'étude

1

Validation du Workflow ntdp

Les chercheurs ont d’abord utilisé trois complexes protéiques: carbonic anhydrase II(CA II，~29.1 kDa)，streptavidin (SA， ~53 kDa) ，avidin (AV，~67 kDa) Vérifier la reproductibilité et la robustesse de ce système Nano - ESI - faim - MSN. Les résultats suggèrent que le système peut stabiliser les complexes protéiques isolés et fragmentés, produisant des données de spectrométrie de masse qui élucident efficacement la caractérisation des protéines (Figure 2 - 4). Il a également été vérifié que faim pouvait isoler des complexes protéiques allant jusqu'à 70 kDa au niveau de la phase gazeuse. (Figure 5)

Figure 2: spectrogramme ntdp de Ca II et sa carte de fragmentation générée par prosight Lite (cliquez pour l'agrandir)

Figure 3: spectrogramme ntdp de sa et sa carte de fragmentation générée par prosight Lite (cliquez pour l'agrandir)

Figure 4: spectrogramme ntdp de av et sa carte de fragmentation générée par prosight Lite (cliquez pour l'agrandir)

Figure 5: diagramme de migration du pic basal du complexe protéique standard et ses valeurs de CV

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2

Analyse ntdp MCF - 7 et

MCF - 7 – extrait de cellules EGFR

Les chercheurs ont ensuite isolé des extraits cellulaires de cellules cancéreuses du sein (MCF - 7 et MCF - 7 - EGFR) avec le système nsec, et les résultats du spectre nsec ont montré que les complexes protéiques extraits de MCF - 7 et MCF - 7 - EGFR (16 expériences répétées) étaient tous stables et efficaces pour la séparation. Les complexes protéiques isolés ont été détectés avec le système Nano - ESI - faim - MSN, co - mesuré104 complexoformes de 17 complexes protéiquesY compris les complexes protéine - métal, les complexes protéine - protéine - métal et les complexes protéine - protéine.

Figure 6: profils nsec des marqueurs protéiques et agrégats protéiques dans MCF - 7, profils nsec des marqueurs protéiques et agrégats protéiques dans MCF - 7 - EGFR, profils nsec des marqueurs protéiques et agrégats protéiques dans MCF - 7 - EGFR, profils nsec des agrégats protéiques dans MCF - 7 - EGFR. (cliquez pour l'agrandir)

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Analyse de caractérisation de complexes protéiques associés au cancer du sein

• Formes complexes de TPI :Le TPI est une enzyme glycolytique associée au cancer du sein et des études ont montré que le TPI pourrait être lié à la résistance aux médicaments, à la progression tumorale et aux métastases. Les chercheurs ont observé des structures dimères de TPI dans les cellules MCF - 7 et MCF - 7 - EGFR avec une masse moléculaire d'environ 53 kDa (nsec - fraction4). Le complexe dimère TPI est formé par la combinaison de variants protéiques monomères tronqués et phosphorylés sur lesquels se produisent deux désamidifications (N15 et n71). Les chercheurs ont également découvert des complexes TPI formés à partir de monomères TPI mutés (e104d) et que les TPI de la Sous - unité de monomère e104d peuvent être phosphorylés, désamidés ou acétylés.

Figure 7: spectrogramme ntdp du complexe TPI complexoforms dans des extraits de cellules MCF - 7 (cliquez pour l'agrandir)

• Formes complexes MIF :Le MIF est une cytokine multifonctionnelle biologiquement pertinente dans une variété de cancers, de maladies auto - immunes et d'inflammations, et les chercheurs ont constaté que le MIF est fortement exprimé dans les cellules MCF - 7 et MCF - 7 - EGFR, et le profil ms1 natif fournit des informations détaillées sur les complexes MIF, formant un total de cinq structures trimériques MIF (homologues et hétérologues). Par MSnL'analyse du spectrogramme a révélé des variants tronqués, non modifiés, nitrosolés et acétylés des protéines monomères MIF (nitrosolés et acétylés respectivement sur C80 et k77).

Figure 8: spectrogramme ntdp du complexe MIF complexoforms dans des extraits de cellules MCF - 7 (cliquez pour l'agrandir)

• Formes complexes de SOD1 :La métalloenzyme sod1 est un antioxydant important pour la formation de tumeurs mammaires induites par les oncogènes et la conversion des superoxydes en o2Et h2O2Essentiel. Les chercheurs ont observé des structures dimériques de sod1 avec une masse moléculaire d'environ 32 kDa dans les cellules MCF - 7 et MCF - 7 - EGFR, et du cu dans la Sous - unité du variant de la protéine sod1 à partir du spectrogramme ms1 (11 + état de charge) et du spectrogramme ms2 (6 + état de charge).2 +Et Zn2 +Liaison non covalente des ions métalliques, le variant protéique sod1 porte également une acétylation n - terminale, une paire de liaisons disulfure (C57 - C111) et une excision de la Méthionine n - terminale.

Figure 9: spectrogramme ntdp du complexe sod1 complexoforms dans des extraits de cellules MCF - 7 (cliquez pour agrandir l'image)

• Formes complexes NUTF2 :Nutf2 est une protéine dimère qui Médie le transport intranucléaire de la petite Enzyme GTP Ran. Les chercheurs ont identifié un total de 8 variants de la protéine nutf2 dans différentes combinaisons de PTM à partir de cellules MCF - 7 et MCF - 7 - EGFR, et ces monomères ont été distribués dans 26 complexes différents. D'après le spectrogramme ms1, la teneur en complexes dimères endogènes nutf2 est significativement réduite dans le MCF - 7 - EGFR par rapport aux cellules MCF - 7 et les hétérodimères nutf2 à trois acétylations sont spécifiques aux cellules MCF - 7 - EGFR.

Figure 10: spectres ntdp de nutf2 dans les extraits cellulaires MCF - 7 et MCF - 7 - EGFR (cliquez pour agrandir l'image)

Figure 11: informations sur la Force des complexoformes nutf2 et des protéoformes dans les extraits de cellules MCF - 7 et MCF - 7 - EGFR (cliquez pour agrandir l'image)

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4

Interaction entre les voies EGFR et Er médiées par nutf2

Les résultats préliminaires des données ntdp ont révélé que le nombre de dimères nutf2 dans les cellules MCF - 7 - EGFR était significativement plus faible que dans les cellules MCF - 7, et les chercheurs ont utilisé la co - précipitation de nutf2 avec deux étiquettes d'affinité différentes pour vérifierConclusion selon laquelle l'EGFR peut induire la dissociation des dimères du facteur de transport nucléaire 2 (nutf2)Le site de modification post - traductionnelle (PTM) de nutf2 est conservateur chez les vertébrés, et la structure cristalline du complexe protéique nutf2 indique que K4 est proche du site de fixation de la porine nucléaire. K55 et k63 sont proches du site de liaison au Ran, où k55 est impliqué dans le contact à médiation aqueuse entre Ran et nutf2, de sorte que les chercheurs ont muté les sites K4 et k55. Les résultats montrent,L'expression de nutf2 dans les cellules MCF - 7 inhibe la croissance des cellules cancéreuses du sein, la mutation k4q inverse cette inhibition et la mutation k55r renforce l'inhibition., ce qui suggère que les sites PTM (K4, k55) peuvent réguler la croissance cellulaire en influençant la liaison des pores nucléaires ou l'interaction Ran. Nutf2 régule à la baisse le gène de prolifération induite par les œstrogènes greb1, tandis que la mutation k4q peut restaurer ce phénotype sans 4oht. Cela suggère que les protéoformes nutf2 à différents sites PTM conduisent à des résultats biologiques différents.

Figure 12: nutf2 régule la signalisation de er et inhibe la croissance

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Pour approfondir la recherche sur la façon dont nutf2 régule la signalisation er et la réponse à 4oht, l'analyse technique cut & Run a révélé que les sites de liaison de er à nutf2 dans les cellules MCF - 7 ne se chevauchent pas, mais que l'expression de nutf2 et le traitement de 4oht modifient le mode de liaison de er. L'expression de nutf2 entraîne des différences dans la fixation de er à 1353 sites et MCF - 7 vs MCF - 7 après traitement par 4ohtNUTF2Les sites de liaison er des cellules se chevauchent et diffèrent. Mais seulement 132 demi - sites de motifs er partagés (i.e. '1 - aggtca') ont été trouvés dans les sites nutf2 sensibles à la 4oht, ce qui suggère que nutf2 régule l'occupation et l'activité de la chromatine er par des mécanismes indirects. Pour mieux comprendre les mécanismes moléculaires de l'inhibition de la croissance de nutf2, les chercheurs ont complété l'ARN - seq des cellules MCF - 7 et MCF - 7 nutf2, et l'analyse de l'enrichissement en gènes a montré que plus de 600 gènes exprimés différemment, y compris les gènes liés au catabolisme de l'ARN, les composants du complexe NuRD (tels que HDAC1) et le gène d'apoptose errfi1, les gènes liés à la Phosphorylation oxydative mitochondriale (tels que BCL2) et les gènes cancérigènes (tels que les gènes de la famille RAS), étaient régulés à la hausse. L'analyse de l'enrichissement des voies a montré que ces gènes sont impliqués dans une variété de cancers et de voies liées à l'EGFR, soutenant le rôle de nutf2 en tant que facteur d'effet de signalisation de l'EGFR. Des études protéomiques de proximité avec erα - apex2 ont montré que l'expression de nutf2 modifiait le Groupe d'interaction avec erα, y compris une augmentation du marqueur junb, une diminution du marqueur des suppresseurs de tumeurs hspbp1 et csde1, entre autres. En comparant les cellules nutf2: WT aux cellules nutf2: k4q, des différences ont été observées dans le Groupe d'interaction er (par exemple, augmentation du marqueur cnot9 et diminution du marqueur dnmt3a), ce qui confirme que nutf2 affecte la voie en régulant les interactions protéiques liées à er.

Figure 13: interactions de nutf2 - er

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quatre

Conclusion et signification

1

Mise en place et application réussies de la méthodologie ntdp

L'étude optimise le flux de travail ntdp en combinaison avec la chromatographie d'exclusion de taille Native hors ligne (nsec), l'ionisation nanoelectrospray (Nano - ESI), la spectroscopie de mobilité ionique asymétrique de champ (FAIMS) et la spectrométrie de masse en tandem Multi - étapes (MSN) pour identifier avec succès 104 complexoformes de 17 complexes protéiques, y compris les complexes protéine - métal, protéine - métal, protéine - protéine, etc., à partir de cellules cancéreuses du sein (MCF - 7 et MCF - 7 - EGFR) et pour caractériser les assemblages protéiques endogènes ≤ 70 kDa, dépassant les méthodes traditionnelles d'analyse des protéines de faible abondance dans des échantillons biologiques complexes.Limites du complexe massique.

2

Découverte et résolution fonctionnelle de complexes protéiques clés

Des complexes protéiques clés liés au cancer tels que la phosphopropolyse isomérase (TPI), le facteur inhibiteur de la migration des Macrophages (MIF), les complexoformes de la Superoxyde dismutase (sod1) ont été identifiés, précisant leurs sites de modification post - traductionnelle (PTM) tels que la désamidification du TPI, la phosphorylation, la nitrosylation du MIF, l'acétylation, le site de liaison métallique de sod1, etc.) et leurs effets sur la structure et la fonction du complexe. Découverte principale: la surexpression de l'EGFR induit la dissociation des dimères du facteur de transport nucléaire 2 (nutf2). Les dimères nutf2 sont impliqués dans l'entrée nucléaire de Ran en tant que protéines de navette de trou nucléaire, et leur surexpression peut inhiber la croissance des cellules cancéreuses du sein, tandis que des mutations à différents sites PTM (K4 et k55) inversent ou aggravent cet effet inhibiteur, suggérant que les PTM de nutf2 affectent la croissance du cancer du sein en modulant la voie de signalisation du récepteur aux œstrogènes (ER).

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Mécanisme d'association de nutf2 avec la résistance endocrinienne dans le cancer du sein

Nutf2 inhibe la croissance des cellules cancéreuses du sein en influençant indirectement les voies de signalisation er en régulant la liaison de l'ADN et les réseaux d'interaction protéique de l'er, tels que la régulation à la baisse du gène de prolifération induite par l'œstrogène greb1, la régulation à la hausse du gène d'apoptose errfi1, etc. La surexpression de l'EGFR (modèle endocrinien de résistance au traitement) réduit les niveaux de dimère nutf2, modifie son schéma PTM, provoque un effet régulateur anormal de nutf2 sur la signalisation er et peut être l'un des mécanismes importants de la résistance au tamoxifène médiée par l'EGFR.

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Importance du domaine du ntdp

Cette approche offre un nouveau paradigme pour l'analyse à grande échelle de complexes protéiques endogènes dans des échantillons biologiques complexes, la rétention d'interactions non covalentes fragiles et la caractérisation précise des PTM, des modes d'assemblage et de la liaison des Ligands du protéoform, ouvrant de nouvelles voies de recherche en biologie du cancer, en découverte de cibles médicamenteuses et en biologie structurale, en particulier pour comprendre les mécanismes moléculaires de résistance au traitement du cancer du sein.

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