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Thermo Fisher Scientific consumables for chromatography
Nouvelle réponse aux normes nationales - GB 5009.299-2024 détermination de la Lactoferrine dans les aliments
Date :2025-05-27Lire :0
Le lait cru de vache est riche en plusieurs protéines actives naturelles telles que l'alpha - lactalbumine (Alpha lactalbumine), la bêta - lactoglobuline (bêta lactoglobuline), la Lactoferrine (Lactoferrine, LF), l'immunoglobuline G (immunoglobuline G, IgG) et la lactoperoxydase (Lactoperoxidase, LP), entre autres, qui jouent un rôle important dans la lutte contre les bactéries, les invasions virales, le renforcement de l'immunité, la réparation des tissus et la croissance et le développement. Dans lequel la Lactoferrine est capable de participer au métabolisme du fer dans l'organisme, favorise l'absorption et le transport des éléments de fer dans le corps, a des fonctions antibactériennes, anti - inflammatoires, antioxydantes, antitumorales et renforce l'immunité. Différents traitements thermiques (pasteurisation, stérilisation à ultra haute température (UHT), concentration par évaporation et séchage par atomisation, etc.) peuvent entraîner différents degrés d'inactivation dénaturante de la Lactoferrine dans les produits laitiers, ce qui affecte sa valeur nutritionnelle et son prix de vente sur le marché.
Faits saillants du nouveau programme de réponse aux normes nationales de symerfly
1. Cet essai a été effectué en référence aux normes GB 5009.299-2024, NY / t 4439 - 2023 et aux normes de groupe et d'entreprise pertinentes pour déterminer la teneur en Lactoferrine du lait pasteurisé, du lait ultra - pasteurisé et des préparations pour nourrissons et jeunes enfants.
2. Pour obtenir une bonne forme de crête et un bon degré de séparation, le test a été correctement optimisé pour le traitement pré - échantillon et les conditions de chromatographie liquide, à une température de colonne de 30 ° C et un débit de 1,0 ml / min, pour0,1% trifluoroacétate d'eau - 0,1% trifluoroacétate d'acétonitrileL'élution graduée est réalisée en phase mobile, la pression maximale du système ne dépassant pas 106 bar.
3. Les résultats de l'essai montrent: une solution standard de Lactoferrine (50,0 µg / ML) un facteur d'asymétrie du pic chromatographique de 1,00, une bonne forme de pic, un nombre théorique de plateaux de 30 549, une excellente efficacité de la colonne; Trois prélèvements successifs, le temps de rétention et la DSR de la zone du PIC sont inférieurs à 1%, la reproductibilité de la méthode est bonne; Un rapport signal sur bruit de 8,2 pour le point bas linéaire (1,00 μg / ML) et une sensibilité élevée de la méthode; Gamme linéaire 1,00 - 200 μg / ML, coefficient de corrélation linéaire r2≥ 09998, bonne linéarité.
4. Dans le test de détermination de la teneur en Lactoferrine dans les produits laitiers par chromatographie liquide en phase inverse, la colonne de chromatographie biobasic 4 (diamètre des pores 300 Å) associée au système de chromatographie liquide haute performance Vanquish Core a montré une bonne reproductibilité et une excellente stabilité, les limites de détection de la méthode et les limites de quantification répondant aux exigences standard et pouvant être utilisées comme référence par les entreprises laitières et les laboratoires d'essais alimentaires.
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GB 5009.299-2024
Symerfly solutions d'application complètes
Traitement avant échantillon
1.1 extraction des échantillons
1.1.1Échantillon liquide: lait cryogénique (lait cru de vache, lait pasteurisé) / lait normal (lait stérilisé à ultra haute température (UHT))
Peser l'échantillon de 5 G (exactement 0,1 mg) dans un tube centrifugeur gradué de 50 ml à capuchon rotatif, doser à 25,0 ML avec du tampon phosphate II, extraire 3 min sous agitation vortex et centrifuger 15 min à 12 000 tr / min à 4°C. Laisser reposer à température ambiante, enlever la couche supérieure de graisse flottante et prendre le surnageant à purifier.
1.1.2Échantillon solide: lait en poudre (formule pour nourrissons et jeunes enfants)
Peser l'échantillon de 2 G (exactement à 0,1 mg) dans un tube à centrifuger gradué à capuchon rotatif de 50 ml, ajouter la quantité appropriée de tampon phosphate II pour dissoudre à chaud par agitation vibratoire, peser avec le tampon phosphate II à 50,0 ML, extraire par commotion Vortex pendant 3 min, laisser reposer plus de 30 Min et centrifuger à 12 000 tr / min 4 ℃ pendant 15 min. Laisser reposer à température ambiante, enlever la couche supérieure de graisse flottante et prendre le surnageant à purifier.
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1.2 purification des échantillons
1.2.1Activation: l'extrémité inférieure de la colonne hypersep d'affinité héparine (P / N: 60105 - 110 - b) est reliée à un dispositif d'extraction en phase solide, l'extrémité supérieure est reliée à un dispositif d'extraction en phase solide par un adaptateur (P / N: 60104 - 259) en série avec une cartouche vide de seringue de 10 ml, additionnée de 2 x 5 ml de tampon phosphate II d'affinité héparine activée, débit de goutte contrôlé 2J / 3S;
1.2.2Échantillon supérieur: l'étape à activer lorsque le niveau du liquide est proche de la plaque de tamis de la colonne, exactement retirer 10,0 ml de l'échantillon ci - dessus dans le cylindre vide de la seringue (P / N: s7510 - 10), contrôler la vitesse de goutte à goutte 2D / 3S, éliminer l'effluent;
1.2.3Lavage: lorsque le niveau de liquide de l'étape d'échantillonnage est proche de la plaque d'écran de la colonne, ajouter 2 × 5 ml de tampon phosphate II pour laver la colonne, éliminer l'effluent, retirer l'adaptateur et la cartouche vide de la seringue, essorer la colonne sous pression négative pendant 2 min;
1.2.4élution: 2 x 2,5 ml de tampon phosphate I sont ajoutés pour éluer, tout l'éluant est recueilli et dosé à 5,00 ML avec le tampon phosphate I sur un filtre à aiguilles en PTFE hydrophile de 0,2 µm (P / N: 42213 - NPL), le filtrat étant à tester en machine.
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Configuration de l'instrument et conditions chromatographiques
Thermo Scientific ™ Vanquish Core ™ Système de chromatographie liquide à haute performance, configuration: pompe Quaternary Pump C (VC - p20 - a), échantillonneur automatique Split Sampler CT (VC - A12 - a), thermostat colonne column Compartment C (VC - C10 - a), détecteur Diode Array Detector CG (VC - d11 - a), traitement de données chromeleon ™ 7.3
Colonne de chromatographie: biobasic 4, 5 µm, 4,6 x 250 mm (P / N: 72305 - 254630)
Phase mobile: A: 0,1% trifluoroacétate d'eau B: 0,1% trifluoroacétate d'acétonitrile
Débit: 1,0 ml / min
Procédure d'élution en gradient:
Quantité d'échantillon: 50 µl
Température de la colonne: 30℃
Détecteur: Dad, longueur d'onde d'acquisition: 280 nm; fréquence d'acquisition: 5 Hz; acquisition spectrale: 190 - 400 nm
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Cartes spectrales et données
3.1 spectrogrammes d'isolement et données de la solution standard de Lactoferrine
Figure 1 Profil d'isolement et données de la solution standard de Lactoferrine (50,0 μg / ML)(cliquez pour l'agrandir)
Comme le montre la figure 1, la solution standard de Lactoferrine (50,0 µg / ML) a un temps de rétention de 12137 min, un bon pic chromatographique, un facteur d'asymétrie de 1,00, une excellente efficacité de colonne et un nombre de plateaux théoriques de 30549. La Lactoferrine présente un pic d'absorption caractéristique à 280 nm.
3.2 spectrogramme de superposition d'échantillons continus de solution standard de Lactoferrine
Figure 2 spectrogramme de superposition d'échantillons en continu de solution standard de Lactoferrine (50,0 µg / ML, n = 3) (cliquer pour l'agrandir)
La solution standard de Lactoferrine (50,0 μg / ML) a été échantillonnée trois fois de suite, avec un temps de rétention et une DSR de moins de 1% de la surface du pic, une bonne reproductibilité de la méthode, des profils de séparation et des données détaillées dans la figure 2.
3.3 spectrogramme de superposition des courbes d'étalonnage de la solution de Lactoferrine standard
Figure 3 spectrogramme de superposition des courbes d'étalonnage de la solution étalon de Lactoferrine (1,00 / 5,00 / 10,0 / 50,0 / 100 / 200 μg / ML) (cliquez pour l'agrandir)
Comme le montre la figure 3, gamme linéaire de solutions standard de Lactoferrine de 1,00 à 200 μg / ML, coefficient de corrélation linéaire r2≥ 09998, bonne linéarité.
3.4 spectrogramme de superposition du Nadir linéaire de la solution standard de Lactoferrine avec la solution vierge
Figure 4 le point le plus bas linéaire (1,00 μg / ML) de la solution standard de Lactoferrine est superposé au spectrogramme de la solution vierge (cliquez pour l'agrandir)
Lorsque le volume d'entrée est de 50 µl, avec une hauteur de crête de Lactoferrine (1,00 µg / ML) de s, on choisit une valeur moyenne de bruit de matrice de 10,5 - 11,5 min de n, un rapport signal sur bruit bas linéaire S / n = 8,2, la sensibilité de la méthode de dosage de La Lactoferrine étant relativement élevée, comme le montre la figure 4.
3.5 pics et réponse de la solution standard de Lactoferrine sous un système de phase mobile eau - acétonitrile 0,1% trifluoroacétate
Figure 5 spectrogramme de superposition d'une solution étalon de Lactoferrine sous un système de phase mobile eau - acétonitrile 0,1% trifluoroacétate (cliquer pour agrandir l'image)
Comme le montre la figure 5, lorsque la phase mobile B est de l'acétonitrile pur, le pic de Lactoferrine subit un important dérapage, ce qui entraîne une mauvaise réponse au Nadir linéaire (1,00 µg / ML) qui ne peut pas être intégrée automatiquement et les limites de détection de la méthode ne répondent pas aux exigences de la norme. Conditions de chromatographie recommandées par la norme industrielle intégrée de Lactoferrine NY / t 4439 - 2023 et par la norme collective T / tdstia 006 - 2019, cet essai sélectionne finalement 0,1% d'eau trifluoroacétique - 0,1% d'acétonitrile trifluoroacétique comme phase mobile pour une élution graduée avec une pression maximale du système ne dépassant pas 106 bar.
3.6 spectrogrammes de séparation des échantillons de lait pasteurisé (lait cryogénique), de lait ultra - pasteurisé (lait ordinaire) et de préparations pour nourrissons et jeunes enfants
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La Lactoferrine est très sensible à la température, ce qui peut perturber sa structure chimique et son activité biologique, ce qui empêche l'enrichissement efficace de la colonne d'affinité à l'héparine. La teneur en Lactoferrine du lait pasteurisé (lait cryogénique) est de 13,4 mg / kg, comme le montrent les figures 6 à 8; La Lactoferrine n'est pas détectée dans le lait ultra - stérilisé (lait ordinaire) et dans les préparations pour nourrissons et jeunes enfants.
GB 5009.299-2024 consommables de chromatographie connexes recommandés
Colonnes d'analyse et de protection | |
BioBasic 4, 5 μm, 4,6×250 mm | (N/P : 72305-254630) |
Noyau de colonne de protection biobasic, 5 μm, 4,0 × 10 mm, 4 PK | (N/P : 72305-014001) |
Housse de colonne de protection uniguard à connexion directe | (P/N : 850-00) |
Traitement avant échantillon | |
Colonne d'affinité hypersep héparine, 3 mg, 10 / PK | (N/P : 60105-110-B) |
Unité d'extraction sous vide en phase solide pour chambre en verre hypersep, 16 positions | (N/P : 60104-232) |
Adaptateur pour transfert de colonne SPE de 1 ml, 3 ML, 6 ML, 15 / PK | (N/P : 60104-259) |
National Target seringue jetable entièrement en plastique, Luer-Slip, 10 mL, 100/pk | (N/P : S7510-10) |
Titan 3 filtre à aiguille en PTFE hydrophile, 17 mm, 0,2 μm, 200 / PK | (N/P : 42213-NPL) |
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Références
[1] GB 5009.299-2024 détermination de la Lactoferrine dans les aliments standard nationaux pour la sécurité alimentaire
[2] NY / t 4439 - 2023 détermination de la Lactoferrine dans le lait et les produits laitiers chromatographie liquide à haute performance
[3] t / tdstia 006 - 2019 détermination de la Lactoferrine dans le lait et les produits laitiers par chromatographie liquide
[4] t / ccaa 70 - 2023 détermination de la teneur en Lactoferrine des préparations pour nourrissons à base de lait de vache chromatographie liquide - spectrométrie de masse en tandem